Способ диагностики нарушения липидного обмена Советский патент 1987 года по МПК A61B5/00 G01N33/49 

11324637

Изобретение относится к медицине

и может быть использовано в клинической практике для определения нарушения липидного обмена.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение точности диагностики за счет использования в качестве биологического материала тромбоцитов крови и определения активности катеп- сина С и фосфолипазы А .

Способ осуществляется следующим образом.

У больного отбирают кровь, центрифугируют ее с этилендиаминтетраацета- том натрия (ЭДТА). Отделяют плазму, из которой после центрифугирования с фиколом выделяют тромбоциты. Выделенные тромбоциты осаждают цинтрифу- гированием, промывают, гомогенизируют

Активность ферментов выражают в наномолях субстрата, гидролизованного за 1 мин 1 мг белка.

Получают количество фосфолипазы 5 А, в норме равное 0,57 -Ь 0,07, а ка- тепсина С 1,68 ± нмоль/мин/мг белка.

При увеличении этих значений для катепсина С и фосфолипазы А выше JO 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидного обмена.

П р и м е р 1. У пациента В., 27 лет, с нормальной массой тела, без клинических признаков шаемической бо- 15 лезни сердца (ИБС) отбирали 10 мл крови в пробирку, содержащую 1,0 мл ЭДТА, и центрифугировали 20 мин на центрифуге при 150 g. После центрифугирования отбирали надосадочную

в растворе сахарозы и ЭДТА. Гомогенат 20 жидкость и наслаивали на 6%-ный раствор фиколла с 76% верографином, центрифугировали 20 мин при 300 X g, от- бирапи мутную полоску, содержащую тромбоциты, центрифугировали 30 мин

делят на две части, к одной из которых добавляют С-лецитин, а к другой - глицил-Ъ-фенилапанин- -нафтил- амид. Образцы инкубируют в течение

30 мтг при 37°С и радиометрически на 25 при 1200 х g. Белый осадок тромбоци- сцинцилляционном счетчике определяюттов промывали в 3,0 мл 0,15 М трисактивность продуктов гидролиза фосфо- НС1 буфере (рН 7,4) и центрифугировали 10 мин при 1200 X g. Полученный осадок гомогенизировали, используя в 30

липазы А, а продукт гидролиза катепсина С - свободный ji, -нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при, волне возбуждения 336 нм и -волне испускания 414 нм.

качестве суспендирующей среды 0,25 М раствор сахарозы с 0,001 М ЭДТА.

0,1 мл гомогената тромбоцитов инкубировали 30 мин при с 0,1 мл субстратно-буферного раствора (5 мМ

Активность фосфолипазы А определяют по формуле

А,

t X 0,5 X CB С - концентрация субстрата; Р - процент гидролиза; t - время инкубации; Cft - концентрация белка.

Активность катепсина С определяют формуле

F X С

А.

F 51X t X 0,1 X С

а

де F - интенсивность флюоресценции анализщ уемого гомогената

тромбоцитов;

t - время инкубации-, интенсивность флюоресценции

стандартного раствора /х,-наф- тиламина С - концентрация стандартного

раствора -нафтипамина (Rea- па , Венгрия), Cg - концентрация белка.

Активность ферментов выражают в наномолях субстрата, гидролизованного за 1 мин 1 мг белка.

Получают количество фосфолипазы А, в норме равное 0,57 -Ь 0,07, а ка- тепсина С 1,68 ± нмоль/мин/мг белка.

При увеличении этих значений для катепсина С и фосфолипазы А выше 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидного обмена.

П р и м е р 1. У пациента В., 27 лет, с нормальной массой тела, без клинических признаков шаемической бо- лезни сердца (ИБС) отбирали 10 мл крови в пробирку, содержащую 1,0 мл ЭДТА, и центрифугировали 20 мин на центрифуге при 150 g. После центрифугирования отбирали надосадочную

НС1 буфере (рН 7,4) и центрифугировали 10 мин при 1200 X g. Полученный осадок гомогенизировали, используя в 0

АК

качестве суспендирующей среды 0,25 М раствор сахарозы с 0,001 М ЭДТА.

0,1 мл гомогената тромбоцитов инкубировали 30 мин при с 0,1 мл субстратно-буферного раствора (5 мМ

5 гли-фен-N А, 2 мМ дитиотрентола, 4 мМ ЗДТА и 0,2% тритона Х-100 в 0,2 М растворе ацетатного буфера, рН 5,0), вносили 1,8 мл глицил-NaOH буфера, рН 10,4. Интенсивность флюо0 ресценции определяли при волне возбуждения 336 нм и волне испускания 414 нм.

Активность катепсина С 1,46 нмоль/мин/мг белка.

5 0,5 мл гомогената тромбоцитов ин- , кубировали 30 мин при с 150 нмоль С-лецитина, 160 мкмоль ацетатного буфера, рН 4,5. Продукты гидролиза разделяли с помощью тонко0 елейной хроматографии и измеряли их активность на сцинтилляционном счетчике, рассчитывали процент гидролиза лизолицитина.

Активность фосфолипазы А Ф

5 0,59 нмоль/мин/мг белка.

Всего в контрольной группе было . обследовано 8 человек. Среднестатистические цифры активности по группе составляли дпя катепсина С 1,68 +

+ 0,27, для фосфолипазы А 0,57 -ь + 0,07 нмоль/мин/мг белка.

Пример2. У больного Р., 34 лет, с ожирением II степени активность лизосомальных гидролаз в трем- 5 боцитах определяли аналогично примеРУ 1 .

Активность катепсина С Ац 3,20, а активность фосфолипазы А, Ф 2,13 нмоль/мин/мг белка. О

Всего было обследовано в этой группе 8 больных с ожирением. Средне.- статистические цифры активности по группе составляли для катепсина С

3.68+ 0,53, для фосфолипазы А 2,26+15 ± 0,24 нмоль/мин/мг белка.

ПримерЗ. У больного К.,

43лет, с ИБС активность лизосомальых гидролаз в тромбоцитах определяли аналогично примеру 1 .20

Активность катепсина С А 7,88, а активность фосфолипазы А л 1,99 нмоль/мин/мг белка.

Всего в этой группе было обследовано 36 больных ИБС с нормальной мае- 5 сой тела и ожирением. Среднестатистиеские цифры активности по группе составляли для катепсина с 7,41 ± 1,45, для фосфолипазы А 1,78 ± ± 0,34 нмоль/мин/мг белка.30

Пример 4. У больного Д.,

44лет, с ИБС и ожирением I степени активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах определяли аналогично римеру 1, до и после проведения кур- 35 са диетотерапии.

Активность катепсина С до лечения 7,90, после лечения А 3,91 нмоль/мин/мг белка.

Активность фосфолипазы А до ле- 40 чения Аф 1,92, после лечения Аф 1,01 нмоль/мин/мг белка.

Всего в этой грулпе было обследо- в.ано 30 больных с ИБС и ожирением. Среднестатистические цифры активности 45 по группе для катепснна С до лечения

7.69± 1,02, после лечения 3,87 +

+ 0,59 нмоль/мин/мг белка (р 0,01), для фосфолипазы А до лечения 2,13 ± + 0,25, после лечения 1,09 ± .50 ± 0,14 нмоль/мин/мг белка (р 0,01).

Сводные данные по активности лизосомальных гидролаз в тромбоцитах 10 пациентов представлены в таблице.

Как видно из приведенных примеров величина нормальных значений активности катепсина С и фосфолипазы А в контрольной группе обследованные соответствовала 1,68 + 0,27 и 0,57 + + 0,07 нмоль/мин/мг белка. У больных с нарушеным липидным обменом с клинической картиной ИБС и ожирением (п 44) в тромбоцитах наблюдалось увеличение активности лизосомальных катепсина С до 6,73 .± 1,49 (р :0,001) и фосфолипазы А до 1,87 ± + 0,41 (р 0,01) нмоль/мин/мг белка. Под влиянием лечения у больных ИБС и ожирением в тромбоцитах активность катепсина С снижалась с 7,69 ± 1,02 до 3,87 ± 0,59 (р 0,01), а фосфолипазы А с 2,13 1 0,25 до 1,09 ± 0,14 (р 0,01) нмоль/мин/мг белка, приближаясь к нормальным значениям. Курс диетотерапии проводили у 30 больных с нарушенным липидным обменом, у 9 из них активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах после лечения вернулась к норме.

Предлагаемый способ может служить контролем эффективности диеты при коррекции метаболических нарушений у больных ИБС и ожирением.

Формула изобретения

Способ, диагностики нарушения ли- пидного обмена путем отбора биологического материала и определения в ней лизосомальных гидролаз, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повьш1ения точности диагностики, в качестве биологического материала используют тромбоциты крови, определяют в них активность лизосомальных катепсина С и фосфолипазы А и при значениях активности вьш1е 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка соответственно диагносцируют нарушение липидного обмена.

Редактор 0.Головач

Составитель Н.Гуляева Техред Л.Сердюкова

Заказ 2986/2Тираж 595

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Корректор М.Пожо

Подписное

Изобретение относится к медицине, предназначено для определения нарушения липидного обмена в клинической практике. Цель изобретения - упрощение способа и повьппение точности диагностики. Для этого пробу крови пациента центрифугируют с эти- ленлиаминтетраацетатом натрия (ЭДТА). Отделяют плазму, из которой после центрифугирования с фиколом выделяют тромбоциты. Выделенные тромбоциты осаждают центрифугированием, промывают, гомогенизируют в растворе сахарозы и ЭДТА. Гомогенат делят на две части, к одной из которых добавляют ь-лецитин, а к другой - гли- цил-Ь фенилаланин-, Ь-нафтш1амид. Образцы инкубируют в течение 30 мин, | при 37°С и радиометрически на сцин- цилляционном счетчике определяют активность продуктов гидролиза фосфо- липазы А, а продукт гидролиза катеп- сина С - свободный -нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при волне возбуждении 366 нм и волне испускания 414 нм. Активность фосфоли- пазы А определяют по формуле Аф (С-Р) t 100-0,5-Сб, где С - концентрация субстратаi Р - % гидролизаJ t - время инкубации; С - концентрация белка. Активность катепсина С определяют по формуле Ац (F-C) : ( х X 0,1-Со, где F - интенсивность флюоресценции анализируемого гомогената тромбоцитов; t - время инкубации, Fg - интенсивность флюоресценции стандартного раствора /ь-нафтиламина; С„ - концентрация белка. Активность в ферментов выражают, в наномолях субстрата, гидролизованного за 1 мин 1 мг белка. Количество фосфолипазы А, в норме 0,57 + 0,07 нмоль/мин/мг белка, катепсина С - 1,68 + 0,27 нмоль/мин/ /мг белка. При увеличении этих значений выше 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидногр обмена. 1 табл. § (Л