Способ получения человеческого инсулина или его аналогов Советский патент 1987 года по МПК C07K14/62 A61K38/28 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения человеческого инсулина или его аналогов биологически-активного соединения, которое находит применение в медицине .

Цель изобретения - упрощение процесса и повьшение выхода целевого продукта.

Пример 1. S-сульфонат А-цепи свиного инсулина (360 мг) растворяют в 36 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5

рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 H.-NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл О,1М глициновог g буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10

с помощью 0,15 мл 5 н. NaOH. К О,5 раствора В-цепи добавляют 0,8 мл раствора А-цепи и 0,035 мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25°С 10 для обеспечения соотношения -SH.,-SS 0,91. Получающийся раствор перемеши вают при 4-8°С в течение 4 ч в откр том флаконе. Анализ смеси с помощью ЖХВР показал, что выход бычьего инс

с помощью 5 н. NaOH. S-сульфонат В-це-15 лина составляет 1,96 мг или 30% от

пи свиного инсулина (300 мг) растворяют в 30 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и доводят рН смеси до 10,5 с помощью 5 н. NaOH. Дитиотриетол (ДТТ) (123,4 мг) растворяют в 4 мл. OjIM глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 0,2 t-ui 5 н. NaOH.

Растворы А- и Б-цепей соединяют в CMfecb объемом 100 мл при комнатной температуре (-- 25°С), а затем добавляют 1,91 мл дитиотриетола (ДТТ) для

обеспечения соотношения -8Н„-830

| о

1,04, Получающийся раствор осторожно перемешивают в открытом химическом стакане магнитной мешалкой при температуре 4-8 С в течение 20 ч. Анализ с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения указывает на то, что выход инсулина составляет 193,8 мг, т.е. 29% от общего количества белка.

40 мл этого раствора довели до рН 3,15 с помощью уксусной кислоты. Смесь подвергали гель-фильтрации на колонке Сефадекс G-50 (Суперфайн, Superfine) размерами 5x200 см, уравновешивали и элюировали 1М уксусной кислотой при 4-8 С. Фракции, содержащие инсулин (объем элюции около 2450-2700 мл), объединяют и лиофили- зируют с извлечением 95 мг инсулина, что составляет 25% от общего количества белка. Свиной инсулин по данным электрофореза в полиакриламидном геле, аминокислотного анализа, инсу- лин-радиорецепторного анализа, жидкостной хроматографии и восстановления глюкозы в крови кроликов достаточно чистый продукт.

Пример 2. Приготавливают растворы S-сульфонатов А- и В-цепей бычьего инсулина концентрацией 5 мг/мл в 0,01М глицинового буфера (рН 10,5).

35

общего количества белка.

Пример 3. Приготавливают растворы 8-сульфонатов А- и В-цепей бычьего инсулина, имеющие концентра

20 цию 10 мг/мл, в 0,1 М глициновом бу фере (рН 10,5). рН каждого раствор доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH ДТТ (61,7 мг) растворяют в 2,0 мл воды, дистиллированной в стекле, К

25 0,5 мл раствора В-цепи добавляют 0,6 мл раствора А-цепи и 29,25 мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25°с) для обеспечения соотношения -SH -SSOj 1,00. Получающийс

30 раствор перемешивают при 4-8 С в от крытом флаконе объемом 3 м в течени 20 ч. Анализ смеси ЖХВР показал, чт выход свиного инсулина составляет 3,81 мг или 35% от общего количеств белка.

Пример 4. Приготавливают растворы S-сульфоната В-цепи челове ческого (панкреатического) инсулина и нескольких S-сульфонатов А-цепей человеческих (панкреатическая и E.Coli) и свиных (панкреатических) инсулинов концентрацией 5 мг/мл в 0,1М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5

45 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл О,Ш глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5, добавляя 0,16 мл 5 н. NaOH. К 1,0 мл каждого раствора S-сульфонатов А-цепей добавляют 0,5 мл раство ра S-сульфоната В-цепи и 0,05 мл раствора ДТТ при комнатной темпе ра- туре (25°С) для обесТгечения соотнош ния -SH -SSOj 1,09. Все растворы пе

gg ремешивают в прохладной комнате

(4-8 С) в открытом флаконе в течени 20-22 ч. Затем их анализируют с помощью ЖХВР с использованием в качес ве стандарта панкреатического челов

40

50

77902

рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 H.-NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл О,1М глицинового g буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5

с помощью 0,15 мл 5 н. NaOH. К О,5 мл раствора В-цепи добавляют 0,8 мл раствора А-цепи и 0,035 мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25°С) 10 для обеспечения соотношения -SH.,-SSO 0,91. Получающийся раствор перемешивают при 4-8°С в течение 4 ч в открытом флаконе. Анализ смеси с помощью ЖХВР показал, что выход бычьего инсу5

общего количества белка.

Пример 3. Приготавливают растворы 8-сульфонатов А- и В-цепей бычьего инсулина, имеющие концентра0 цию 10 мг/мл, в 0,1 М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 2,0 мл воды, дистиллированной в стекле, К

5 0,5 мл раствора В-цепи добавляют 0,6 мл раствора А-цепи и 29,25 мл раствора ДТТ при комнатной темпера туре (25°с) для обеспечения соотношения -SH -SSOj 1,00. Получающийся

0 раствор перемешивают при 4-8 С в открытом флаконе объемом 3 м в течение 20 ч. Анализ смеси ЖХВР показал, что выход свиного инсулина составляет 3,81 мг или 35% от общего количества белка.

Пример 4. Приготавливают растворы S-сульфоната В-цепи человеческого (панкреатического) инсулина и нескольких S-сульфонатов А-цепей человеческих (панкреатическая и E.Coli) и свиных (панкреатических) инсулинов концентрацией 5 мг/мл в 0,1М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5

5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл О,Ш глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5, добавляя 0,16 мл 5 н. NaOH. К 1,0 мл каждого раствора S-сульфона тов А-цепей добавляют 0,5 мл раствора S-сульфоната В-цепи и 0,05 мл раствора ДТТ при комнатной темпе ра- туре (25°С) для обесТгечения соотношения -SH -SSOj 1,09. Все растворы пеg ремешивают в прохладной комнате

(4-8 С) в открытом флаконе в течение 20-22 ч. Затем их анализируют с помощью ЖХВР с использованием в качестве стандарта панкреатического челове0

0

ческого инсулина для вычисления выходов .

Результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

2,00 26,7

2,11 28,1

1,95 26,0

2,03 27,1

1,99 26,5

Пример 5. Приготавливают раствор каждого из S-сульфонатов А- и В-цепей человеческого инсулина концентрацией 5 мг/мл в О,1М глициновом буфере (рН 10,5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН доводят до 10,5 с помощью 0,16 мл 5 н. NaOH. К 0,5 мл раствора В-цепи добавляют при комнатной температуре 1,0 МП раствора А-цепи, а затем 50 мл раствора ДТТ для обеспечения соотно3Q Все элюированные белки лиофилизуют. Пик инсулина (объем элюции 2465- 2781 мл) весит 125 г и представляет 29,4% извлеченного белка.

Часть инсулинового пика (95,5 мг) растворяют примерно в 9 мл 0,01М трис-0,001 ЭДТА-7,5М мочевины - 0,03 NaCl буфера (рН 8,5 при ). Смесь подвергают хроматографии через ион-обменную колонку размером

0,2,5x90 см ДЭАЭ-целлюлозы (диэтилами- ноэтил), уравновешенную тем же самым буфером. Белок элюируется при градиентом концентраций NaCl 0,03-0,09М в объеме 1 л в том же

ЗЬ

шения -SHj-SSOj

равным 1,09. Получаю- 45 змом буфере, а затем 1 л буфера,

щийся раствор перемешивают при темпе- содержащего 1М NaCl. Каждый из пиков

обессоливают на колонках Сефадекс G-25 (грубых) в 2%-ной уксусной кислоте и лиофилизируют. Пик инсулина (объем элюции 878-1008 мл) весит 55,73 мг и составляет 84% извлеченного белка.

Кристаллы цинк-инсулина получают растворением 11,90 мг пробы инсулинового (ДЭАЭ) пика в 240 мл 0,1 н.

ратуре 4-8 С в открытом флаконе объемом 3 мл в течение 22 ч, после чего анализ с помощью ЖХВР указьтает на то, что выход человеческого инсулина равен 2,58 мг, что составляет 34% от общего количества белка.

Пример 6. S-сульфонат А-цепи инсулина человека (328 мг) растворяют в 65,6 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5 с помощью 75 мл 5 н. NaOH. S-сульфонат В-цепи инсулина человека (164 мг) растворяют в 32,8 мл О,1М глициново50

55

НС1 с последующим быстрым добавлением 2,16 мл 0,04%-ного раствора ZnClg - 0,05М цитрата натрия - 15% ацетона в стеклянной центрифужной

5

0

го буфера (рН 10,5) и рН смеси доводят до 10,5, добавляя в нее 15 кл 5 н. NaOH. ДТТ растворяют в 4,0 мл О,1М глицинового буфера (рН 10,5) и рН раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH.

Растворы А- и В-цепей соединяют в стекляниста стакане объемом 150 мл при комнатной температуре ( 25 с) и добавляют 3,28 мл раствора ДТТ для обеспечения соотношения 1,09. Открытый стакан помещают в баню с ледяной водой в прохладной комнате и энергично перемешивают в течение 10 мин. Затем раствор перемешивают в течение 24 ч в прохладной комнате (4-8 С). Проведенный в этот момент анализ с помощью ЖХ5Р определили выход, равный 148 мг или 30% от общего количества белка.

К 100 мл этого раствора добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты до тех пор, пока значение рН не стано5 вится равным 3,15. Весь материал подвергают гель-фильтрации на колонке Сефадекса G-50 (Суперфайн) размером 5x200 см, уравновешенной и элюирован- нрй Ш уксусной кислотой при .

Q Все элюированные белки лиофилизуют. Пик инсулина (объем элюции 2465- 2781 мл) весит 125 г и представляет 29,4% извлеченного белка.

Часть инсулинового пика (95,5 мг) растворяют примерно в 9 мл 0,01М трис-0,001 ЭДТА-7,5М мочевины - 0,03 NaCl буфера (рН 8,5 при ). Смесь подвергают хроматографии через ион-обменную колонку размером

0,2,5x90 см ДЭАЭ-целлюлозы (диэтилами- ноэтил), уравновешенную тем же самым буфером. Белок элюируется при градиентом концентраций NaCl 0,03-0,09М в объеме 1 л в том же

Ь

50

Кристаллы цинк-инсулина получают растворением 11,90 мг пробы инсулинового (ДЭАЭ) пика в 240 мл 0,1 н.

НС1 с последующим быстрым добавлением 2,16 мл 0,04%-ного раствора ZnClg - 0,05М цитрата натрия - 15% ацетона в стеклянной центрифужной

пробирке. Кристаллизация проходит в течение 72 ч при комнатной температуре (25°С), после чего супернатант извлекают и кристаллы дважды промывают в холодной воде с рН 6,1 с цент- .рифугированием при 2000 об/мин при 3 С между промывками. Кристаллы повторно растворяют в 0,01 н. НС1 для анализа..

Полученный препарат человеческо- го инсулина считают совершенно чистым после электрофореза в полиакрил- амидном. геле (одна линия), анализа аминокислот, инсулинового радиорецеп- торного анализа, инсулинового радио- иммуноанализа, ЖХВР, дансилирования и УФ-спектроскопии. Анализ на крови кроликов давал активность, равную 26,3 1,8 ед. на мг безводного вещества.

П р и м е р 7. Бьш приготовлен раствор S-сульфонат А-цепи человеческого E.coli Ы-формил-Гли инсулина и раствор S-сульфоната В-цепи человеческого (панкреатического) инсу- лина концентрацией 5 мг/мл в 0,01М глициновом буфере (рН 10,-5). рН каждого раствора доводят до 10,5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ (61,7 мг) растворяют в 4,0 мг глицинового буфера (рН 10,5). рН доводят до 10,5 с помощью 0,16 мл 5 н, NaOH. К 1,5 мл раствора S-сульфоната В-цепи добавляют 1,О мл раствора ДТТ при комнатной температуре (25°С) для обеспече- ния соотношения -ЗН -ЗЗО 1,10. Раствор перемешивают в прохладной комнате (4-8°С), в открытом флаконе объемо 3 мл в течение 23 ч, после чего проводят анализ с помощью ЖХВР. Анализ показывает, что выход (К-формил- Гли-)-А человеческого инсулина равен 19,5% от общего количества белка.

После подкисления до рН 3,15 с по мощью ледяной уксусной кислоты часть этого раствора подвергают гель-фильтрации на колонке Сефадекс С-50 (Супе файн) размером 1,5x90 см, уравновешенной и элюированной 1М уксусной кислотой при 4-8 С. Пик (N-формил- Гли )-А человеческого инсулина (объем элюции 87-95 мп) собирают, берут из него аликвоту, а оставшуюся часть лиофилизируют. Белок считают чистым на основании анализа ЖХВР и аминокислотного анализа. Биологическую активность (К-формил-Гли )-А человеческог инсулина оценивают с помощью радиорёцепторного анализа; активность составляет 17% по отношению к стандарту человеческого инсулина.

Пример 8. Готовили раствор А-цепи свиного S-сульфоната концентрации 10 мгУмл в 0,1 М глициновом буфере (рН 10,5) и такой же раствор В-цепи человеческого S-сульфоната (E.coli). А-В пул готовили, беря 2 м раствора А-цепи на 1 мл раствора .рН А-В-пула устанавливали рав ньпу 10,5 с помощью 5 н. NaOH. Цисте- ин (121,2 мг) растворяли в 3,0 мл 0,1М глицинового буфера (рН 10,5) и устанавливали рН полученного раствор равным 10,5, добавляя к нему 0,35 мл 5 н. NaOH. К 1,4 мл А-В-пула добавляли при комнатной температуре 52 мкл раствора цистеина, в таком расчете, чтобы соотношение между -SH и -SSO равнялось 0,95. Полученный раствор перемешивали, при 4-8 С в открытой пробирке объемом 3 мл в течение 20 ч, после чего проводили анализ на пролактин из плаценты человека. Выход инсулина человека составлял 3,25 мг (23,2% от общего содержания белков).

Пример 9. Проведен рентгенографический анализ человеческого инсулина, полученного как полусинтетическим (NOVO) способом, так и способом рекомбинатной ДНК (LiLL). Кристаллы- человеческого инсулина имеют комбоэдрическую ячейку пространственной группы R ,85 А, С 34,1 А и-почти изоморфны кристаллам 2-инсу- лина свиньи (,50 А, ,0 А).

Точные фотографии кристаллов человеческого инсулина, полученного обоик и способами, не отличаются друг от друга и от панкреатического человеческого инсулина, однако между человеческим инсулином и инсулином свиньи имеются заметные различия в распределении интенсивностей.

Тщательный кристаллографический расчет как NOVO, так и LL инсули- нов с использованием разрешения 1,9А проведенный быстродействующим Фурье- методом наименьших квадратов, показывает, что в пределах ошибки эксперимента структуры обоих человеческих йнсулинов идентичны и очень близки к инсулину свиньи за исключением С-кон- ца цепи Б. После оптимизации различия в расположении атомов в человеческих инсулинах NOVO и LiLL составляют: 0,15 А только для атомов осново

ной цепи и 0,22 А для всех атомов. Эти различия меньше, чем различия между Двумя молекулами в димере 2 Zn-инсулине свиньи. Конформация боко- 5 вой лизиновой цепи В29 хорошо определяется для обеих молекул, причем в молекуле инсулина свиньи обнаружены две различные конформации. Атомы основной цепи ВЗО в обеих молекулах су- О щественно сдвинуты, в частности у карбоксильных групп. Обнаружены также изменения структуры воды при сравнении кристаллических структур человеческого инсулина и инсулина свиньи в области В28-ВЗО.

Влияние концентрации белков на реакцию соединений цепей А-В.

Цель: подробная оценка оптимальной общей концентрации белковых цепей в реакции соединения цепей А+В инсулина человека. Методика: получают 7 мл раствора А (SSOj) из свиньи с концентрацией 25 мг/мл и 4 мл раствора В (SSO ) из E.coli (B-gal) с концентрацией 25 мг/мл в 0,1М глициновом буфере с рН 10,5. 6,0 мл раствора А-цепи и 3,0.мл раствора В-це- пи объединяют. Затем объединенный раствор доводят до рН 10,5 с помощью 5 н. NaOH. ДТТ получают растворением 61,7 мг в 4,0 МП 0,1М глицинового буфера с рН 10,5, и снова доводят до рН id,5 с помощью 140 мкл 5 н. NaOH. В объединенный раствор цепей А/В прибавляют 1,64 мл раствора ДТТ.

Оптимальное соотношение SH/SSOJ 1,.20 бьшо определено ранее с теми же ДТТ и цепями при концентрации белка, равной 10 мг/мл. Концентрация 40 белка в реакции соединения цепей А+В не должна существенно влиять на оптимальное содержание ДТТ.

ствительной концентрации белка в каж дом образце.

Результаты, приведенные вьше, показывают наличие реального, четкого оптимума до концентрации белка, равного 8 мг/мл для реакции соединения цепей человеческого альбумина.

Исследование рН: соединение А+В цистеин.

Цель: оценка оптимального значени рН для реакции соединения А+В+цистеи

Методика: соединяют 10 мл раствора А-цепи и 5 мл раствора В-цепи в 0,1 М глициновом буфере с рН 10,5. f5 Раствор цистеина получают растворением 121,2 мг в 3,0 мл глицинового буфера и последующим доведением рН до 10,5 с помощью 350 мкл 5 н. NaOH. Аликвоты указанного объединенного 20 раствора А/В, имеющие объем по 1,4мл доводят при комнатной температуре до указанных ниже значений рН. Прибавля ют 57 мкл раствора цистеина, после чего рН сразу доводят до исходного значения. После этого каждый образец помещают в холодную комнату (6°С) и перемешивают в течение ночи в З-мил- лилитровой .ампуле.

30

35

Результаты: был проведен ЖХВД-ана- лиз через 24-27 ч проведения реакции при 6°С с использованием аликвот, разбавленных ледяной уксусной кислотой 1:2. Рассчитаны действительные выходы в реакции соединения цепей. Зависимость от рН обнаруживает четкий оптимум около рН 10,5.

Вывод: в реакции соединения А+В+ +цистейн обнаружен четкий оптимум при рН 10,5.

Исследование рН: соединение А+В.

Цель: подробная оценка интервала рН около значения рН 10,5 в начале

реакции соединения цепей А+В для оп- Раствор, в котором проводится ре- 5 Р Д ления критических отклонений в

значении рН и точного значения оптимального рН, приводящего к оптимальному выходу инсулина.

Методика: 120 мг свиного А (SSOj)

акция соединения, сразу разделяют на аликвоты и помещают в 11 ампул емкостью по 3 мл, содержащих различные количества О,1М глицинового буфера. Каждую ампулу перемешивают в течение 50 человеческого В (SSOJ), по- ночи при .лученного из E.coli (trp Е) , раствоДействительная общая концентрация ряют соответственно в 12,0 и 6,0 мл цепей учитывает данные аминокислотного анализа (88,8 мас.% А-цепи,88 мае.% В-цепи), а также добавление ДТТ и за- 5 н. NaOH.

данные факторы разбавления. 1/27 ЖХВД- 61,7 мг ДТТ растворяют в 4,0 мп анализ проводят сразу после проведе- 0,1 М глицинового буфера и снова до- ния реакции в течение 22-25 ч. Данные водят рН до 10,5 с помощью 140 мкл по выходу рассчитывают на основе дей- 5 н. NaOH.

0,1 М глицинового буфера с рН 10,5 и снова доводят до рН 10,5 с помощью

О

ствительной концентрации белка в каждом образце.

Результаты, приведенные вьше, показывают наличие реального, четкого оптимума до концентрации белка, равного 8 мг/мл для реакции соединения цепей человеческого альбумина.

Исследование рН: соединение А+В цистеин.

Цель: оценка оптимального значения. рН для реакции соединения А+В+цистеин.

Методика: соединяют 10 мл раствора А-цепи и 5 мл раствора В-цепи в 0,1 М глициновом буфере с рН 10,5. 5 Раствор цистеина получают растворением 121,2 мг в 3,0 мл глицинового буфера и последующим доведением рН до 10,5 с помощью 350 мкл 5 н. NaOH. Аликвоты указанного объединенного 0 раствора А/В, имеющие объем по 1,4мл, доводят при комнатной температуре до указанных ниже значений рН. Прибавляют 57 мкл раствора цистеина, после чего рН сразу доводят до исходного 5 значения. После этого каждый образец помещают в холодную комнату (6°С) и перемешивают в течение ночи в З-мил- лилитровой .ампуле.

40

30

35

Результаты: был проведен ЖХВД-ана- лиз через 24-27 ч проведения реакции при 6°С с использованием аликвот, разбавленных ледяной уксусной кислотой 1:2. Рассчитаны действительные выходы в реакции соединения цепей. Зависимость от рН обнаруживает четкий оптимум около рН 10,5.

Вывод: в реакции соединения А+В+ +цистейн обнаружен четкий оптимум при рН 10,5.

Исследование рН: соединение А+В.

Цель: подробная оценка интервала рН около значения рН 10,5 в начале

ряют соответственно в 12,0 и 6,0 мл 5 н. NaOH.

0,1 М глицинового буфера с рН 10,5 и снова доводят до рН 10,5 с помощью

Указанные растворы хранят в упаковке из льда в течение подготовки индивидуальных реакционных образцов. Каждый, образец полностью завершают до того, как начинают подготовку еле дующего образца.

Следзтощий эксперимент проводили прибавлением реагентов в заданном порядке в открытые З-миллилитровые ампулы и перемешиванием в холодной комнате (6 с) с помощью магнитной мешалки.

Доведение рН очень точно.

проводят быстро и Перечисляемые ниже ре

зультируюшзие значения рН представля- ют собой точные исходные значения рН при 6 С, при которой реакцию начинают и проводят.

Результаты; после проведения реакции в течение 4-5 ч несколько образцов подвергнуты прямому анализу с помощью ЖХВД. После проведения реакции в течение 1 дня все образцы бьши подвергнуты анализу с помощью ЖХВД.

Данные ЖХВД, рассчитанные относительно ЖХВД-анализа стандартного инсулина свиньи.

Приведенные данные ясно показьша- ют, что рН 10,5 соответствует оптимуму для начала проведения реакции соединения А+В.

Проведенные опыты показьшают, что рН является крайне важным фактором, определяющим хорошие выходы инсулина. Первоначальный рН, равный 10,5, при данной температуре реакции должен соблюдаться во всех других реакциях соединения.

Для получения максимального выхода инсулина нет необходимости далее поддерживать первоначальный рН реакции, равный 10,5.

Эксперимент по проведению реакции соединения свиной цепи А ( человеческой цепи В ( обнаружи/-

вает о достаточно воспроизводимых

выходов реакции соединения: 23,6; 24,7| 23,5; 23,0; 23,0 и 23., 1% со средним выходом 23,5%.

Выводы: этот эксперимент ясно показывает, что оптимальным значением рН является 10,5, а также что в реакции соединения А+В исходное значение рН играет решающую роль.

Реакция соединения А+В и цистеин (ЦИС).

Цель: определить, можно ли использовать аминокислоту цистеин в качест

0

5

0

5

0

ве восстанавливающего тиол недорогого агента в реакции соединения цепей А+В.

Методика: свиную А (SSOj) и Е.со- 11 В (SSOj)g, используют для получения смешанного раствора А/В с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с рН 10,5.

Раствор L-цистеина в форме свобод- 0 ного основания (м.в.121,16) получают растворением 121,2 мг в 3,0 мл 0,1 М глицинового буфера, после чего рН доводят до 10,5 с помощью 350 мкл 5 н. NaOH.

Различные количества цистеина прибавляют к 1,4 мл апиквотам смешанного раствора А/В при рН 10,5. Через 17-21. ч проведения реакции при б°С проводят ЖХВД-анализ.

Результаты: получена зависимость от SH/SSO, типичная для многих зависимостей для ДТТ. Оптимальный выход, равный 23,3%, хорошо сравним с выходом белка, равным 24-27% и получаемым с ДТТ. Оптимальные выходы как для ДТТ, так и для цистеина, получены при одинаковом соотношении . ЗН/350з 1,2.

Вьтоды: в реакции соединения цепей А+В цистеин рабртает также, как ДТТ. .

Реакция соединения А+В с меркапто- проционовой кислотой и с меркапто- янтарной кислотой.

Цель: оцределить, можно ли использовать -меркаптопропионовую кислоту (сокращенно МПК) или меркаптоянтар- ную кислоту (сокращенно МЯК) в качестве восстанавливающих тиол агентов в реакции соединения цепей А+В.

Методика: свиную А (SSOJ) и Е.со- 11 (SSOj)2 используют для получения . смешанного раствора А/В с общей концентрацией 10 мг/мл в глициновом бу- 45 фере с рН 10,5. Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного раствора А/В.

-Меркаптопропионовую кислоту ис- пользук1Т в виде раствора 87 мкл этой 50 кислоты в 4,0 мл глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 200 мкл 5 н. NaOH, М еркаптоянтарную кислоту используют в виде раствора 150,1 мг этой кислоты в 3,5 мл глици- 55 нового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 700 мкл 5 н. NaOn.

Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи при 6 С и подвергают ЖХВД-анализу.

11 1327790 12

-Меркаптопропионовая кислота при- (меркаптоэт1-шамин) в качестве восводит к приемлемым выкодам инсулина, а меркаптоянтарная кислота дает очень плохие выходы. Оптимальное значение для МПК SH/SSOj 1,40 и оно выше, чем в предьщущих исследованиях с этими цепями (выход инсулина 16%.).

Выводы: -Меркаптопропионовая кислота приемлемо эффективна в реакции соединения цепей А+В, а меркаптоян- .тарная кислота как агент декарбокси- лированного тиола весьма плоха.

Меркаптоуксусная кислота и орто- меркаптобензойная кислота.

Цель: определить, можно ли использовать меркаптоуксусную кислоту (МУК) или орто-меркаптобензойную кислоту (МБК) в качестве восстанавливающего тиол реагента в реакции соединения цепей А+В.

Методика: свиную А (SSO). и Е.со- 11 В (SSO ) используют для получения смешанного А/В раствора с концентраВывод: Меркаптоэтанол и цистамин не эффективны в реакции соединения

цией 10 мг/мл в глициновом буфере с 25 цепей А+В. рН 10,5. Для каадого образца исполь- Реакция соединения А+В: цистеин зуют по 1,4 мл этого смешанного А/В, о сравнению с ДТТ.

раствора.Цель: сравнение цистеина и ДТТ в

Меркаптоуксусную кислоту использу- реакции соединения А+В по эффектив- ют в ввде раствора 71 мкл этой кисло- зо ности соединения цепей А и В. ты в 3,9 мл глицинового буфера, приМетодика: растворы цепей А, В и объединенный раствор А/В получают в глициновом буфере (О,1М) с рН 10,5. Различие количества растворов цистечем рН доводят до 10,5 с помощью 300 мкл 5 н. NaOH. Орто-меркаптобензойную кислоту используют в виде раствора 154,2 мг этой кислоты в 3,8 мл глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 400 мкл 5 н. NaOH.

Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи и подвергают ЖХВД-анализу. Затем выход инсулина рассчитывают.

Меркаптоуксусная кислота по сравнению с ДТТ и цистеином приводит к

Методика: растворы цепей А, В и объединенный раствор А/В получают в глициновом буфере (О,1М) с рН 10,5. Различие количества растворов цисте35 ина или ДТТ прибавляют к 1,4 мл

аликвотам объединенного раствора А/В и перемешивают в 3-миллилитровых открытых ампулах в течение ночи при 6 С. Результаты: были проведены расче40 ты выхода, ЖХВД-анализ и расчеты

SH/SSO . Максимальный выход инсулина в реакции соединения А+В составляет 94% от максимального выхода, получае

50

мого с ДТТ. Однако пик зависимости хорошим выходам инсулина, хотя в дан- 45 от SH/SSO: для цистеина более широк ном случае оптимум соотношения SH/SSO (1,0-1,5) чем для ДТТ, (1,2-1,3) и очень широк (1,2-2,0, выход 19,7- 20,5%). Выходы с использованием ор- то-меркаптобензойной кислоты существенно ниже (до 8,6%).

Вывод: в реакции соединения А+В Меркаптоуксусная кислота весьма эффективна, а орто-меркаптобензойная кислота значительно менее эффективна.

Реакция соединения А+В с меркапто- ег -Температурное исследование: реак- зтанолом-ИЛИ цистамином.ция соединения А+В.

Цель: определить, можно ли использовать в реакции соединения цепей А+В J-Меркаптоэтанол или цистамин

это определяет преимущество способа получения.

Выводы: цистеин приводит только к 90-95% от максимального выхода, однако дает более широкий пик зависимости от SH/SSOj по сравнению с ДТТ в реакции соединения цепей А+В.

Цель: изучение зависимости скорости реакции и выхода инсулина при соединении цепей А+В человеческого инсустанавливающего тиол агента.

Методика: свиную А (SSO) и В (SSOj)2 из E.coli используют для

получения.смешанного раствора А/В с концентрацией 10 мг/мл в глициновом буфере с рН 10,5. Для каждого образца используют по 1,4 мл этого смешанного раствора А/В.

-Меркаптоэтанол используют в виде, раствора его 70 мкл в 4,0 глицинового буфера, причем рН доводят до 10,5 с помощью 200 мкл 5 н. NaCH.

Результаты: каждый образец перемешивают в течение ночи при и подвергают ЖХВД-анализу. Выход инсулина рассчитывают. Оптимум соотношения SH/SSO равен 1,25 как для , так и для меркаптозтила; ,ина, и совпадает с оптимумом для ДТТ н цистеи- на, однако максимальные выходы инсулина (8-9%) существенно ниже.

Вывод: Меркаптоэтанол и цистамин не эффективны в реакции соединения

цепей А+В. Реакция соединения А+В: цистеин о сравнению с ДТТ.

реакции соединения А+В по эффектив- зо ности соединения цепей А и В.

Методика: растворы цепей А, В и объединенный раствор А/В получают в глициновом буфере (О,1М) с рН 10,5. Различие количества растворов цисте35 ина или ДТТ прибавляют к 1,4 мл

аликвотам объединенного раствора А/В и перемешивают в 3-миллилитровых открытых ампулах в течение ночи при 6 С. Результаты: были проведены расче40 ты выхода, ЖХВД-анализ и расчеты

SH/SSO . Максимальный выход инсулина в реакции соединения А+В составляет 94% от максимального выхода, получае0

мого с ДТТ. Однако пик зависимости 45 от SH/SSO: для цистеина более широк (1,0-1,5) чем для ДТТ, (1,2-1,3) и

это определяет преимущество способа получения.

Выводы: цистеин приводит только к 90-95% от максимального выхода, однако дает более широкий пик зависимости от SH/SSOj по сравнению с ДТТ в реакции соединения цепей А+В.

Цель: изучение зависимости скорости реакции и выхода инсулина при соединении цепей А+В человеческого инсулина от темп1ературы проведения реакции.

Методика: 149 мг А (SSOJ) из свиньи и 70 мг В (SSOj) из E.coli trp Е растворяют соответственно в 14,9 и 7,0 мл 0,1 М глицинового буфера и доводят до рН 10,5 с помощью 5 н. NaOH. Получают ДТТ в концентрации 61,7 мг в 4,0 мл буфера и доводят до рН 10,5 с помощью 140 мкл 5 н. NaOH.

Образцы трех реакций соединения получают при различных температурах в ампулах емкостью 15 мл так, как указано ниже. Все растворы охлаждают до -1°С. В этой серии экспериментов ,0, а SH/SSOJ 1,11.

Через различные промежутки времени эти образцы после разбавления 1:2

уксусной кислотой проверяют на содер- 20 посредственно не связана с конечным

жание человеческого инсулина с помощью ЖХВД-8/25 анализ. Количественная оценка основана на , -анализе сви- но го инсулина при 15,5 , ,2

Результаты: через 1 сут. образцы снова оценивают для определения конечного выхода инсулина.

- Анализ полученных результатов показывает, что при комнатной температуре реакция соединения начинает протекать очень быстро, но в течение короткого промежутка времени (3 ч), образование инсулина прекращается при низком выходе инсулина (9,8%), максимум достигается за 3-5 ч, содержание инсулина медленно падает (через 22 ч выход 4,8%). При 6°С реакция образования инсулина протекает несколько быстрее, чем при О с до времени проведения реакции, равного 6 ч, однако конечные выходы при времени проведения реакции 23 ч практически одинаковы (соответственно 24,4 и 24,7%). За исключением проведения реакции при комнатной температуре не было обнаружено разложения инсулина за счет разрьша дисульфйдных связей вплоть до времени проведения реакции, равного 24 ч.

Исходя из реакционных зависимостей в табл. 2, приведены для каждой реакций соединения или время, при котором достигается половина от максимального выхода инсулина.

Т а

лица

Зависимость t

/2 Амакс

ОТ

температуры представляет собой прямую линию. Следовательно, температура обратно пропорциональна t,, , однако не

выходом инсулина.

Выводы: проведение взаимодействия соединений А+В при 0°С по сравнению с проведением процесса в холодной комнате (6°С) несколько замедляет реакцию, однако приводит к тому же саому конечному выходу инсулина (24- 25%). Проведение реакции соединения при комнатной температуре приводит к снижению выхода. Реакцию соединения цепей А+В оптимально следует провоить при 0-6 С в течение 24 ч.

Осуществление предлагаемого способа позволяет повысить выход до 25% с 1-2% и упростить процесс за счет проведения процесса взаимодействия S-сульфонатов А- и В-цепей инсулина в одном аппарате в однофазном растворителе .

Формула изобретения

Способ получения человеческого ин- сулина или его аналогов путем взаимоействия S-сульфоната А-цепи человеческого инсулина или его аналога с S-сульфонатом В-цепи человеческого инсулина, или его аналога в водной, среде в присутствии тиолового восстанавливающего агента и кислорода воздуха, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, процесс проводят в присутствии тиолового восстанавливающего агента, выбранного из группы, состоящей из ди- тиотриетола, дитиоэритрола, меркапто- уксусрой кислоты,f -меркаптопропионо

151327790 16

вой кислоты или цистеина, взятого в воре 5-10 мг/мл, массовом соотнойе- количестве 8-15 мас.% от общего коли- нии А-цепи и В-цепи 1:1,5-2:1 при чества S-сульфонатов А-цепи и В-цепи рН 9-11,5, температуре 0-22 с в те- при общей концентрации белка в раст- ченйе 0,5-24 ч.

Изобретение касается полипёп- тидов, в частности человеческого инсулина (ИН) и его аналогов, которые как биологически активные соединения используют в медицине. Для упрощения получения ИН используют другие восстанавливающие агенты. Синтез ИН ведут из сульфонатов А-цепи (А-ц) и Б-цепи (Б-ц) человеческого ИН или его аналогов в водной среде при общей концентрации белка в растворе 5-10 мг/мл, массовом соотношении А-ц/В-ц(1-2):(1,5-1), рН 9-11,5 и 0-22 С (0,5-24 ч) в присутствии тио- лового восстанавливающего агента. Последний выбирают из группы: дитио- триетола, дитиоэритрола, меркапто- уксусной кислоты, -меркаптопропио- новой кислоты или цистеина, и берут в количестве 8-15 мас.% от общего количества А-ц и Б-ц. Способ обеспечивает выход ИН до 25% с проведением процесса в одном аппарате в однофазном растворителе. 2 табл. О)