Способ определения активности цитохромоксидазы Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 C12Q1/00 

1

Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии, и может использоваться для определения активности цитохромоксидазы (ЦХО).

Цель изобретения - сокращение вре .мени определения.

Пример. Исследования проводя на митохондриальной фракции головног мозга. Определяют активность сукци- натдегидрогеназы (СДГ), спектрофото метрическим методом по степени восстановления цитохрома С за счет окисления сукцината. Для определения активности СДГ составляют инкубаци- онную среду, котррая содержит: 0,05 м белка митохондриальной суспензии; 0,1 мл 1,5 1 раствора сукцината натрия; 0,1 мл 0,15 М раствора KCN; 0,05 мл 8- 0 м раствора CaCi , 0,05 мл 8-10 М раствора А1С1 ;

. ц„

2,5 мл 110 М раствора дитохрома С Изменение оптической плотности при восстановлении цитохрома С регистрируют на СФ-4а в течение 3 мин.

Активность фермента выражают в мкмолях цитохрома С на 1 мг белка в мин. Следующим этапом в работе является определение коэфффициентов i по специально составленным табл« 1 и 2. Соответствующие значения коэффициентов а, oi, а,, и величину атмосферного давления (мм рт. ст.), при котором проходил эксперимент, подставляют в формулу (1) для отыскания Ч (h), Ч (h) , ч (h),

ЛЮ

(1.)

M (h(,.cos -- Затем определенное в эксперименте значение активности СДГ и найденные значения fjCh) (,1,2,3) подставля ют в формулу (2), по которой производят расчет активности ЦХО

(Юх- Ч (h) Ч- (h)x + Ч /h) , , (2) где Y - активность ЦХО; X - активность СДГ; h - величина атмосферного давления, мм рт. ст.;

Q,- коэффициенты линии регрес- 50

сии ч (Ь) cos

IL

50950 ,2

Рассчитанная аналитически активность ЦХО выражается в микромолях цитохрома С на 1 мг белка за 1 мин соотнесенно к h, 5

Например, в услогшях гипотермии () в сочетание с гипоксией (разрежение атмосферы до 310 мм 10 рт. ст.) находим значения функций Ч„(Ь), Y (h), 4(h), ч(Ь) по формулетг

4(h) --7;-,

где а, Q, (д берут соответственно из табл. 1. Значение активности (х) СДГ при этом составляет 25,8 мкмоль цитохрома С на 1 мг белка в 1 мни, - расчетное значение активности(У)ПХО, цитохрома С на 1 мг белка в 1 мин - 72,463668 мкмоль. Экспериментально установленная активность ЦХО составляет 71,,5. Ошибка формулы 0,78%.

25

Формула -изобретения

Способ определения активности цитохромоксидазы путем инкубации ткани в реакционной смеси, содержащей цитохром С, и последующего

спектрофотометрирования, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения, измеряют активность сукцинатдегидро- геназы в ткани, а активность цитохромоксидазы рассчитывают по формуле

Y f(h)x + 4/h)x + ( (h) ,

где f,(h)a , cos ----- (,l,

2,3);

Y активность цитохромоксидазы

цитохрома С на 1 мг белка в 1 мин, мкмоль ;

X - экспериментально полученное значение активности сукцинат- дегидрогеназы цитохрома С на 1 мг белка в 1 мин, мкмоль;

h - величина атмосферного давления, мм. рт. ст.; а„,а,,

эмпирические коэффициенты функции ч (h) .

у (h) Значение коэффициентов функций

V.(h) (,1,2,3) при

«о , .

V(h) -0,00004 0,019375 -0,00313 , (h) -0,001399 0,019375 0,28062

Ч (h) 0,081155 0,019375 -5,38519 5

f(h) -0,55573 0,019375 78,431198

Таблица 2

Ч .(Ь) Значение коэффициентов функций f. (h) (,1,2,3) при t 37 C

«„ I

)-о ,.00910,000600,00752

4,(h)-0,226400,00060-0,68357

y/h)-3,544010,000604,03097

М з(Ь)-17,186630,00060-26,11705

Составитель.H. Гуляева Редактор М. Келемещ Техред И.Гайдош Корректор Е. Рошко

.. «... п .1.iL----.-..г-г |л-гг .--1Г .1,-- - - - .- - -.--.-.- И -- -------

Заказ 4403/39Тираж 778Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

.-|,, -|.J. - - .ЦЛ-ЦТ- -т- .гг.- -. -T---lll|-nj -- - - - - -- - - - -.-.-.---.-

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблица 1

Изобретение относится к биохимии, а именно к энзимологии. Цель изобретения - сокращение времени определения активности цитохромоксида- зы..Определяют активиость сукцинатдегидрогеназы спектрофотометричеСкнм методом по степени восстановления цитохрома С за счет окисления сукци- ната. Затем рассчитьшают Y активиость цитохромоксидазы по формуле Y « Ч (h)x + f/h)x + 4,(h)x-t-4 (h), где Ч .(Ь)а - -ад-со8 , 1, 2, 3; X - экспериментально полученное значение активности сукцинат- дегидрогеназы, ТГ - 3,1 А; h - величина атмосферного давления в мм рт. ст., а, а, а эмпирические коэффициенты функции Ч(Ь). 2 табл. П а, -h