Способ диагностики гемолитической болезни новорожденного Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, в частности, к педиатрии.

Цель изобретения - повыпение точ- .ности диагностики гемолитической болезни новорожденного.

Способ осуществляется следующим образом.ч

Цитохимические методы определения активности ферментов в лейкоцитах предложены Р.П. Нарциссовым,

Выявление сукцинатдегидрогеназы (СДГ).

Свежезаготовленные и высушенные мазки крови фиксируют при комнатной температуре в течение 30 с, в 60е- растворе ацетонтрилоне, приготовленного из 60 мл чистого ацетона и 40 мл дистиллированной воды с добавлением 3-4 г трилона-Б (рН среды 5,2-5,4). Мазки крови промывают в проточной воде и споласкивают дистиллированной водой. Высушивают при комнатной температуре.

Высушенные мазки инкубируют в водяной бане при 37° С в течение 1 ч в среде, приготовленной следующим образом,

В 300 мл фосфатного буфера (200 мл 1/15 М раствора дигидрофосфата ка- лия и 800 мл 5/15 М гидрофосфата натрия смешивают, исходная рН буфера 7,2-7,4) растворяют 78 мг трнлона К и 78 г пара-нитротетраэолия фиолетового. При наличии осадка фильтруют. Базовый раствор: в 40 мл растворяют 540 мг сукцината натрия при 37°СеПро- веряют рН 7,2-7,4.

Выявление альфа-глицерофосфатде- гидрогеназы (об- ГФДГ),

В 40 мл базового раствора при 37 С растворяют субстрат - 630 мг альфа-глицерофосфата, рН среды 7,2 - 7,4.

Выявление бета-оксибутиратдегид- рогеназы (|3 - ОВДГ).

(Л

ел ел

со со о го

К 27 мл ранее приготовленного базового раствора прибавляют 3 мл рабочего раствора f -оксибутирата, 6 мл НАД и 3 мг феназинметасульфата,, с

Рабочий раствор б -оксибутирата готовят следующим образом.

1,5 г оксибутирата растворяют в 30 мл. 1 н. раствора едкого натрия, оводят до рН 7,0 и доливают дистил- f о ированной водой до 100 мл0

После инкубации на водяной бане в термостате мазки в течение 5 мин промывают проточной водой, ополаскивают в дистиллированной воде, За- is тем прокрашивают ядра клеток в 0,5%-ном растворе януса зеленого при рН 5,0-5,2 в течение 10 с при комнатной температуре. Вновь промывают в проточной воде, ополаскивают дис- 20 тиллированной водой. Высушивают, а затем микроскопируют под водяной иммерсией.

Активность каждого фермента оценивают по количеству гранул в 50 лим- 25 фоцитах или по среднему количеству гранул в одном лимфоците.

Определение активности кислой фос- фатазы лимфоцитов () по методу Гольдберг и Барка и Р„П. Нарциссову. -JQ

Свежеэаготовяенные и высушенные мазки крови фиксируют в холодном t +4° С спирт-формалиновом : 9ч. 96 этилового спирта и 1 ч. 40 %-ного раствора формалина) растворе в тече- „ ние 30 с. Промывают проточной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Высушивают при комнатной температуре. Зафиксированные и высушенные мазки инкубируют в среде, состоя- о щей из растворов А и В. Раствор А: 20 мг нафтола АС-БС фосфата растворяют в 0,5 мл диметилформамида и доливают 40 мл холодного раствора 0,1 н. уксуснокислого натрия, Раствор В: д5 8 капель 4%-ного раствора азотисто- кислого натрия соединяют с 8 каплями 4%-ногр раствора солянокислого фуксина (последний должен просветлеть). Растворы А и В смешивают,тща- тельио перемешивают и профильтровы- вают„ Доводят до рН 5,2-5,4, Инкуба- ционную -среду подогревают до 37° С на водяной бане. Инкубируют в сухом термостате при 37°С в течение 2 ч. После инкубации мазки ополаскивают в дистиллированной воде и докрашивают 0,5%-ным раствором метанового зеленого на ацетатном буфере в тече55

5

5

ние 10-15 мин. Вновь промывают в проточной воде, высушивают и микро- скопируют под масляной иммерсией. Активность фермента подсчитывают в условных единицах.

Определение активности щелочной фосфатазы нейтрофилов (ЩФН) методом азосочетания Гольдберг и Барка,

Свежеприготовленные, высушенные и зафиксированные мазки крови (см. определение активности К«ЬН) инкубируют в рабочем растворе, состоящем из растворов А и В.

Раствор А: 300 мг трисаминометана растворяют в 25 мл дистиллированной воды, 20 мг нафтола АС-МХ фосфата растворяют в 0,5 мл диметилформамида, К растворенному нафтолу АС-МХ- фосфату добавляют раствор трисамино- метана.

Раствор В готовят: 10 капель 4%-ного солянокислого фуксина смешивают с 10 каплями 4%-иого раствора азотнокислого натрия

Раствор А и В смешивают, доводят до рН 9,5-9,6 и фильтруют.

Способ инкубации: на подготовленные мазки наносят рабочий раствор на 30 мин при комнатной температуре.

Затем мазки промывают в проточной воде в течение 5-1.0 мин, ополаскивают в дистиллированной воде. Докрашивают мазки 0,5-1%-ным раствором мета- лового зеленого в течение 5-6 мин. Ополаскивают мазки в проточной воде в течение 1 мин, высушивают. Микроскопируют под масляной иммерсией.Активность фермента подсчитывают в усл.ед.

Проведя исследования активности ферментов лейкоцитов цитохимическими методами у 60 больных с целью ранней диагностики гемолитической болезни новорожденных, было отмечено что для развития болезни, также как и ее проявления, характерна ферментативная депрессия, При этом по уровню снижения активности ферментов определяют наличие болезни и степень ее тяжести, которые в последствия подтверждались почасовым нарастанием концентрации билирубина или его абсолютным уровнем.

Пример. Новорожденная С родилась от 2-й доношенной беременности, срочных родов. У матери во время беременности была нефропатия, протекавшая на фоне гипертонической

болезни, 1-й ребенок жив. Данные роды быстрые. Ребенок родился с гипотрофией I степени. Масса тела 2300 гр Оценка по шкале Апгар 8 баллов,Группа крови у матери О (I) резус-отрицательная, у ребенка - О (l) резус- положительная. Титр антирезусных антител у матери во время беременности 1:2. Масса плаценты 450 гр,Состояние новорожденного тяжелое.Пупо- винный остаток прокрашен билирубином Кожный покров бледно-субиктеричен. Вядый, Мышечный тонус и рефлексы новорожденного снижены. В легких и сердце без физикальных особенностей. Брадикардия, частота сердечных сокращений 122/мин. Живот мягкий. Печень увеличена, выступает из-под реберной дуги на 3 см. Селезенка пальпируется в пределах 1 см.

Клинический анализ крови: Эр 4,, Нв - 166 г/л, Цп 1,0, гематокрит 52%, лейкоцитов 7,5 х х 107/л: М 2%, Ю 6%, П 23%, С 53%, М 1%, Л 15%. Нормоциты 162 на 100 лейкоцитов. Ретикулоциты 140%. Биохимический анализ крови: непрямой билирубин из пуповины 146,8 мкмоль/л

Цитохимические показатели активности ферментов лейкоциты сравнивали с показателями в норме, полученными в контрольной группе из 72 практически здоровых новорожденных.

Цитохимический анализ крови, г/кл СДГ 1,7 («ор«а 12,1±1,1, снижение на 98,6%); альфа-ГФДГ 1,1 (норма 7,1±1,0, снижение на 98,5%); бета- ОБДГ 1,4 (норма 14±3,2 снижение на 99%); КФЛ не определяется (норма 24+1,4), ЩФН - не определяется (норма в первые сутки 128±2,9 уел, ед,). Цитохимические исследования проведены через 6 ч после рождения. Выставлен клинический диагноз: гемолитическая болезнь новорожденного, врожденный изоиммуноконфликт по системе резус, желтушно-анемический вариант, тяжелое течение.

Ребенку по жизненным показаниям пров.едена операция закенного переливания крови, в дальнейшем ему проводилась детоксикациоиная инфузионная терапия в сочетании ,с фотолечением и симптоматическими препаратами.Затем новорожденный переведен для дальнейшего лечения на второй этап.

Таким образом, у новорожденного гемолитическая ,болезнь внутриутробно имела очень тяжелое течение.Для диагностики болезни затруднений не было. Данный пример показывает взаимосвязь между тяжестью болезни и ферментативным уровнем лейкоцитов. При тяжелом течении болезни с выраженными симптомами ферментативная активность лимфоцитов и нейтрофилов

практически отсутствует,Следовательно, у новорожденного не было никаких компенсаторных возможностей инакти- вировать непрямой билирубин, что потребовало оперативного вмешательства,

5 П р и м е р 2, Новорожденный В.,

Родился у матери 36 лет от 6-й бере-менности, вторых срочных родов,Роды

стремительные, в головном предлежа. нии. Дородовое излитие околоплодных

о вод, I период - 1 ч,15 мин,, II период - 5 мин. Безводный период 5 ч 20 мин. Околоплодные воды светлые, В анамнезе матери 2 медицинских аборта, 2 самопроизвольных выкидыша, 1

5 роды мертвым плодом - антенательная гибель плода от резус-конфликта,Масса ребенка 3600 граммов. Оценка по шкале Апгар 8-9 баллов, Группа крови у матери О (Т) резус-отрицательная,

0 V ребенка -г О (I) резус-положительная. Титр антирезусных антител у матери во время беременности 1:4.

Объективно: общее состояние новорожденного средней тяжести. Кожный

g покров чист, подкожная клетчатка выражена хорошо, слегка пастозна.Двигательная активность удовлетворительная. Мышечный тонус умеренно снижен. Крупно размашистый тремор конечное0 тей. Рефлексы новорожденного вызываются частично. Сердечные тоны ритмичны, ЧСС - 150 уд./мин. Дыхание пуэрильное, ЧД 48/мин. Живот мягкий. Печень увеличена на 2-2,5 см.Пальпи5 руется край селезенки. Пуповина в повязке. Клинич.анализ крови: Эр 6,5-10 /л; Нв 180 г/л; гематокрит 75; лейкоцитов 21-10 /л: П 6%, С 38%, М 7%, Л 45%; ретикулоцитов 70%,

Биохимический анализ-крови из пуповины: непрямой билирубин 44 мкмоль/л.

Заключение: период адаптации,угрожаемый по развитию ГБН,

Через 4 ч после рождения цитохи5 мический анализ, г/кл: СДГ 9,8; аль- фа-ГФДГ 1; бета-ОБДГ 1; КФЛ 2, 1ЧФН не определяется.

Через 10 ч после рождения: общее состояние резко ухудшилось за счет

Симптомов быстронарастающей билиру- Йинемии, интоксикации. Отмечаются Срыгивания, пастозность тканей лица,, фнижение мьппечного тонуса, заметное угнетение рефлексов новорожденного. Живот мягкий, печень +4 см, селезен- ijca +2 см, В клин, анализе крови: Эр. ji.9 /л, Нв 166 г/л, ге атокрит 50%; лейкоцитов 12,6 10ч/л; ретику- лоцитов 57%0. В биохимическом анали- ие крови уровень непрямого билирубина 118 мкмоль/л, Почасовой прирост составил 7,4 мкмоль/л/ч

Диагноз: гемолитическая болезнь новорожденного, послеродовая, изо- дммуноконфликт по системе резус,жел- гушно-анемический вариант, тяжелое течение, отечный синдром.

Максимальный уровень непрямого билирубина у больного достиг 348,8 мкмоль/л.

Больному произведена операция замененного переливания крови,осуществлялись неоднократные инфузии альбумина, плазмы, детоксикацион- ная терапия, фото- и симтоматическое печение. На долечивание переведен на второй этап.

Таким образом, у новорожденного с большим риеко м развития гемолитической болезни общепринятые методы диагностики не отражали начавшуюся болезнь, Резкое снижение активности ферментов лейкоцитов и даже их отсутствие указывали на тяжелый гемолитический криз, что потребовало проводить операцию замененного переливания крови. Следовательно, состояние уровней активности ферментов лейкоцитов значительно опережает по времени общепринятые методы диагностики

П р и м е р 3. Новорожденная Д., родилась от 7-й доношенной беременности, -вторых срочных родов. Кезвод- ный период 3 ч. Передние околоплодные воды светлые, задние - примесь мекония. Масса тела 2700 граммов. Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов,/ Группа крови матери A(ll) резус-отрицательная, у ребенка A(ll) резус- положительная. Титр антирезусных антител у матери во время беременности 1:2.

Объективно: общее состояние ребенка средней тяжести и обусловлено симптомами легкой степени асфиксии: мышечный тонус снижен, небольшой амплитуды размашистый тремор верхних

0

5

0

5

0

5

0

5

конечностей, нижней челюсти, гипореф- лексия. В легких и сердце физикально без патологии. Живот мягкий. Печень +1 см. Селезенка не пальпируется. Уровень Нв 180 г/л, концентрация непрямого билирубина 49,8 мкмоль/л.

Через 8 ч после рождения у ребенка на фоне сохраняющейся симптоматики появилась едва заметная субикте- ричность кожи лица. Повторно проведены исследования крови: Эр, 5,0 х X 101г/л; Нв 180 г/л, Цп 0,9; лейкоцитов 14 Ю15 /л: М 1%, FO 2%, П 6%, С 61%, Л 25%, М 5%, гематокрит 48%, Ретикулоциты 65%0, нормоциты 7:100 лейкоцитов. Концентрация непрямого билирубина 69,7 мкмоль/л„ На основании имеющихся отклонений заподозрена гемолитическая болезнь. Почасовой прирост билирубина составил 2,4 мкмоль/л/ч. Цитохимический анализ крови, г/кл: СДГ 3,2; альфа-ГФДГ 2,1; бета-ОЯДГ 1,2; КФЛ 4, ЩФН 6 усл.ед.

По уровню активности ферментов лейкоцитов диагноз гемолитической болезни не вызывает сомнения,причем вероятность течения средней тяжести.

На вторые сутки от момента рождения развилась четкая клиническая симптоматика гемолитической болезни новорожденного, желтушно-анемичес- кий вариант, средне-тяжелое течение.

На высоте заболевания гематологические показатели следующие: Эр 3,, Нв 120 г/л, Цп 0,9, лейкоциты /л, гематокрит 40%, концентрация непрямого билирубина 201,6 мкмоль/л.

После проведенного коясервативно- го лечения ребенок выписан на 12-е i сутки в удовлетворительном состоянии I под наблюдение участкового педиатра.

Таким образом, на основании клинических и лабораторных данных гемолитическая болезнь была только заподозрена. При этом обычные методы лабораторных исследований в начале заболевания не предсказывали тяжесть течения, тогда как по степени депрессии активности ферментов предсказана тяжесть гемолитической болезни.

Пример4. Новорожденный П., родился от 1-й беременности, срочных родов. Беременность протекала физиологично. В родах развилась слабость родовых сил: I период - 24 ч, II пе

риод - 1 ч. Безводный период 9ч, Околоплодные воды светлые. Родился мальчик с массой 4200 граммов.Оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. Группа крови у матери О (I) резус-положительная, у ребенка В (ill) резус-положительная. При первичном осмотре новорожденного: кожа чистая, розовая в легких и сердце без особенностей.. Печень и селезенка не увеличены.Рефлекторная деятельность адекватная. Через 12 ч после рождения состояние несколько ухудшилось за счет снижения двигательной активности и появления легкой субнктеричностн кожных покровов. Печень увеличилась на +1 см селезенка не увеличена. Для исключения гемолитической болезни взяты, анализы крови. Клинический анализ крови Ив 220 г1л гематокрит 65; лейкоцитов 12,8-Ю9 /я: 3 3%, П 5%, С 50%, Я 40%, М 2%} иормобласты 12 на 100 лейкоцитов. В биохимическом анализе крови концентрация непрямого билирубина 60,4 мкмоль/л.

Заключение: яа основании клинических симптомов и дополнительных исследований крови не выставлен диагноз гемолитической болезни. Необходимо дальнейшее наблюдение.

С целью окончательного решения о возможной гемолитической болезни новорожденного проведены цитохимические исследования, г/кл: СДГ 4,3 (норма 12,l±i,l, снижение на 65%){ аяьфа-ГФДГ 3,3 (норма 7,Ј1,0, снижение иа 54%);. оета-ОВДГ 1,7 (норма 1413,2, снижение на 88%), КФЛ 9 (норма ,4, еянкекне на 80%); ЦФН 14 усл.ед, (норма ,9, снижение на 89%).

Диагноз: гемолитическая болезнь средней Тяжести,

10

0

53902. 10

Новорожденному проведена консервативная терапия. Состояние улучшилось и на 11-е сутки ребенок выписан под наблюдение педиатра.

Таким образом, у данного ребенка гемолитическая болезнь развивалась по групповой несовместимости. Этот вариант болезни имеет более легкое течение по сравнению с резусконфлик- том. Вероятно поэтому процент снижения активности ферментов лейкоцитов меньше, чем в примерах 1-3,

Из примеров 1-4 и цитохимических исследований следует, что ферменты лейкоцитов по разному отражают свое участие в болезненном процессе,Так, щелочная фосфатаэа нейтрофилов (ЩФН), кислая фосфатаза лимфоцитов (КФЛ), а также бета-оксибутиратдегидроге- наза указывают на наличие самой гемолитической болезни, тогда как СДГ И альфа-ГФДГ отражают ее .тяжесть,

Такое дифференцированное участие ферментов в патологическом процессе,вероятно, объясняется глубиной воздействия токсической фракции билирубина на функциональные органеллы клеток

крови, находящихся в состоянии иммунологической реакции. Как видно из клинических примеров, в первую оче- редь страдают сложные эфиры фосфорных соединений, в аспекте которых

и действуют гидролитические ферменты фосфатаз.

Большая тропность непрямого билирубина к жирным кислотам лнпидов и фосфолипидов является подчеркнутой в активности бета-ОБДТ, Именно этот фермент участвует в промежуточном превращении жирных кислот,

В связи с этим фосфатазы и бета- ОБДГ на уровне клетки первыми реаги

Изобретение относится к области медицины, в частности педиатрии. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого проводят определение активности ферментов лимфоцитов и нейтрофилов цитохимическими методами в первые сутки от момента рождения ребенка. И при снижении уровня активности сукцинат-, альфа-, глицерофосфат- и бета-оксибутиратдегидрогеназ и кислой фосфотазы относительно нормы диагностируют гемолитическую болезнь новорожденного. Способ позволяет с высокой степенью достоверности (100%) осуществлять диагностику заболевания.

ные симптомы интоксикации бнпирубинемии, еще больше двигательная активность и

и гепер- снизилась ответная В

клини- Эр 5,3-10 /л;

На вторые сутки появились выражен- 45 в стадии формирования и начальном периоде гемолитической болезни.

СДГ и аяьфа-ГФДГ - митохондриаль- ные ферменты лимфоцитов больше указывают на тяжесть гемолитической бо50 лезни, т.е. глубину или выраженность иммунологического процесса. В связи с этим по степени снижения их активности можно судить о тяжести патологического процесса. Так, снижение

55 уровня активности этих ферментов в пределах 70-99% от нормы следует от- нести к тяжелому, на 50-69% - к сред нему течению желтушной формы гемолитической болезни.

рефлекторная возбудимость, ческом анализе крови: Ив 166 г/л; лейкоцитов. 18 10 /л; ге- матокрит 45; ретикулоцитов„36%

Содержание непрямого билирубина 167 мкмоль/л.

Диагноз: гемолитическая болезнь новорожденного,послеродовая.изоимму- ноконфликт по системе АВО, желтушно- анемическнй вариант, средней тяжести.

11 1

Обоснованность взятия ферментов в нейтрофилах, в частности ЩФН, для диагностики гемолитической болезни объясняется тем, что эти клетки крови зарождаются, созревают и выходят в сосудистое русло из миелоидной ткани костного мозга, В организме он является единственным местом,где созревают также и эритроциты, т.е. клетки - мишени к антиэритроцитарным антителам. Таким образом, имеется информация о функциональном состоянии миелоидной ткани.

Исследование ферментов лимфоцитов диктуется тем, что гемолитическая болезнь новорожденного формируется с 8-10 недель внутриутробного развития плода, т.е в те сроки, когда закладывается клеточный иммунитет, и в зависимости от степени иммунологической сенсибилизации реализуется до ищи после рождения ребенка,Кроме того, эти клетки имеют полный набор ферментов, обеспечивающие окислительно-восстановительные процессы соответственно их функции.

Цитохимические методы не трудоемки и не требуют сложного специального оборудования, обладают большой диагностической и прогностической информацией,

Предложенный способ диагностики и уточнение тяжести гемолитической

5390212

болезни дает возможность определить и провести своевременную адекватную терапию.

Выявление активности ферментов лейкоцитов в группе новорожденных с большим риском развития гемолитической болезни (резус-несовместимость матери и новорожденного,ток- Ю сикоз и анемия у беременной, наличие желтушности у предыдущих детей, мертворождения, повышенный титр ан- тирезусных антител у беременной и др.) обладает большой дкагностичес- 15 кой информацией в случаях развития патологического процесса. Диагноз гемолитической болезни в доклинической стадии подтвержден в 100% случаев.

Формула изобретения

Способ диагностики гемолитической болезни новорожденного путем определения белков крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа,определяют цитохимически в лейкоцитах активность сукцинат-, альфа-, глицерофосфат- и бета-оксибутиратдегидро4- геназ, кислой и щелочной фосфатаз в момент рождения и при снижении уровня активности ферм ентов относительно нормы диагностируют гемолитическую болезнь новорожденного,