Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах Советский патент 1982 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам биохимическохчэ исследования интенсивности дыхания и образования энергии в клетке мозга.

Известен способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах путем измерения оптической плотности при 600 ммк 2,6-дихлЬрфеноли дефевола восстановлением при окислении сукцината Однако известный способ длителен и не обеспечивает высокой точности.

Наиболее близким к предложенному является чисто химический способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах 2 .

Однако данный способ трер.ует для анализа значительного времени, анализ сложен, способ не позволяет проводить комплексное определение активности сукцинатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы.

Целью изобретения является сокращение времени и упрощение анализе при комплексном определении актив- ности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и НАДН-дегидрогеназы.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа определения активности сукцннатдегидрогеназы в

биологических объектах в пробе определяют Активность НАДН-дегидрогеназы, а активность сукцинатдегидрогеназы рассчитывают по формуле

5

(х-х)+с(х-х,)+а(х-х,) ..(1)

f

где у - активность сукцинатдегидрогеназы; X - активность НАДН-дегидрогена10зы в первом определении,х - активность НАДН-дегидрогеназы при повторном определении;

а,Ь,c,d - эмпирические коэффици15енты корреляционной зависимости .

Способ осуществляют следующим образом.

Берут ткань мозга, в которой тре20буется определить активность ферментов, в том числе СДГ и НАДН-дегидрогеназы. Обычным спектрофотометрическим методом производят 2 замера активности НАДН-дегидрогеназы. Полу

25 ченные данные выражают МКМ цитохром с/мг белка митохондрий за 1 мин. Затем по специальным таблицам определяют значения коэффициентов а, Ь с, d в зависимости от величины

30 .НАДН-дегидрогеназы. Определенные

в экс:1ерименте значения активности НАДН-дегидрогеназы и найденные величины а, Ь, с, d подставляют в формулу (1) и по ней рассчитывают активность СДГ:

y-a+b(x-x)+c(x-x)+d(x-x),

В особых интервадуах активности НАДН-дегидрогеназы формула принимает вид

(x-X2)+c(x-X2)+d(x-X2) , где Х2 2

Пример 1. Определение активности СДГ в ткани мозга здорового кролика-самца. Для определения активности СДГ по предложенному способу в ткани мозга кролика проводят 2 замера активности НАДН-дегидрогеназы. Получают следующие результаты: активность НАДН-дегидрогеназы при первом определёнии 13,4 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий, при повторном определении - 12,8 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий. Определ:.ч)т значения коэффициентов а , b, с, d для интер вала значений активности НАДН-дегидрогеназы 10,5-13,5, так как в него попадают результаты замеров. Получают следующие значения коэффициентов: ,5; ,36; ,03; ,008. Рассчитывают значения активности СДГ по формуле (1):

+ Ь{х-х )+с(х-х } +d(x-x)3

14,5+0,36(13,4-12,8)-0,03(13,4-12,8;2-о,08(13,4-12,а),690

(мкм цитохрома с/мг белка митохондрий) . Для проверки проводят непосредственное экспериментальное определение активности СДГ методом Поттера результат - 14,697 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий в 1 мин.

Пример 2. Определение активности СДГ в ткани мозга кролика,подвергшегося воздействию гипоксии. В исследуемой ткани мозга кролика, подвергшегося воздействию гипоксии, производят 2 замера активности НАДН-дегидрогеназы. Получают следуюпчие результаты: 38,2 МКМ цитохрома с/мг. белка митохондрий, 38,1 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий. Определяют значения коэффициентов корреляционной кривой: ,8/ ,93, ,18. Полученные значения активности НАДН-дегидроназы и коэффициентов корреляционной кривой подставляют в формулу для определения активности СДГ:

у-а+Ь(х-хц)+с(х-х) fd(x-x) 20,8+4,93(38,2-38,1)+0(38,2-38Д)-0,18(38,2-38,1)21,293 (МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий).

Результат непосредственного экспериментального определения 21,287 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий.

Примерз. Определение активности СДГ в ткани мозга кролика, подвергшегося воздействию гипотермии. В исследуемой ткани мозга кролика, подвергшегося воздействию гипотермии производят 2 замера активности НАДН.-дегидрогеназы. Получают результаты: в первом определении 24,1 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий, во втором определении 24, 1 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий. Опведелены значения Коэффициентов корреляционной кривой: ,675; ,36; ,57; ,26. Полученные результаты подставляют в формулу (1) и по ней рассчитывают активность СДГ:

y a+b(x-x)+c(x-x)+d(x-x)

20,675+6,36(24,1-24,1)-14,51(24,1-24,1)2+45,2-6(24,1-24,1),675 , (мкм цитохрома с/мг белка митохондрий) .

Результат непосредственного измерения методом Поттера 20,201 МКМ цитохрома с/мг белка митохондрий.

Предложенный способ применен при проведении определения активности сукцинатдегидрогенаэы в 133 пробах ткани мозга при различных экспериментальных ситугщиях: в состоянии организма 35 опытов, при гипоксии 18 опытов, при гипотермии 15 опытов, при сочетании гипоксии с гипотермией 65 опытов. При этом установлено, что предложенный способ упрощает анашиз проб при комплексном определении активности сукцинатдегидрагеназы и НАДН-дегидрогеназы, так как активность определяется по результатам двух замеров, что сокращает время экспериментальных исследований. Предложенный способ обеспечивает высокую точность анализа, практически не отличающуюся от экспериментальных данных, и расширяет арсенал средств определения активности сукцинатдегидрогеназы.

Формула изобретения

Способ определения активности сукцйнатдегидрогеназы в биологических объектах, о тли чающийся тем, что, с целью сокращения времени и упрощения анализа при комплексном определении активности сукцинатдегидрогеназы и НАДН-дегидрогеназы, в пробе определяют активность НАДН-дегидрогеназы, а активность сукцинатдегидрогеназы рассчитывают по формуле

(x-x)+c(x-x-,) + d(x-x) ,

у - активность сукцинатдегидрогеназы;

X - активность НАДН-дегидрогеназы в первом определении;

х - активность НАДН-дегидрогеназы, при повторном определении)5

а, Ь, с, d - эмпирические коэффициенты корреляционной зависимости..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Асатиани B.C. Ферментные метоtuj анализа, 1969, с. 428.

2.Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., 1969, с. 349-358.