СПОСОБ А. Л. ЯМПОЛЬСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА В КРОВИ Советский патент 1960 года по МПК G01N33/566 

Предлагаемый сиособ определения С-реактивного белка в крови дает возможность улучшения диагностики заболеваний с наличием воспалительных и некротических явлений.

Отличительная особенность способа заключается в том, что С-реактивиый белок определяют с помощью иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов внутривеино раствором С-реактивного белка, выделенного из плеврального (или перитонеального) экссудата больных лимфогранулематозом с использованием для его изоляции СХполисахарида.

Для микроопределения С-реактивного белка предусматривается применение ка пиллярной реакции преципитации с использованием набора, содержащего микроцентрифугу Шкляра на два гнезда, капилляры со штативом для них, микропробирки для центрифуги и штатив к ним, иглу и флакончик с иммунной сывороткой.

Способ осуществляется следующим образом.

Плевральный или перитонеальный экссудат от больного лимфогранулематозом проверяют в реакции кольцепрецинитации с раствором СХ- полисахарида 1:100000. В качестве контроля употребляют тот же экссудат, в который предварительно добавляют 2-3 капли 0,1 М раствора цитрата натрия иа мл экссудата и

тот же раствор СХ-полисахарида. Если в опыте образуется преципитат, а в коитроле он не образуется, то экссудат брать в работу. 2 л экссудата, положительно реагирующего с СХ-полисахаридом, оставляют в холодильнике на 2 дня при . Выпавщий в осадок фибрин удаляют центрифугированием. Добавляют 1 л водопроводной воды и хорощо высущенный сульфат аммония ПО 313 г иа 1 л разведенного экссудата. Хорощо перемешивают и, спустя несколько минут после полного растворения, осадок удаляют фильтрацией через несколько бумажных или полотняных фильтров.

На каждый литр фильтрата добавляют по 175 г сульфата аммония и через несколько минут после растворения выиавншй осадок отфильтровывают на бумажные диски в вороиках Бюхнера с прокладками из бумажной массы с помощью водоструйного насоса. Лепешки альбуминов снимают с бумаги ножом и растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды. Раствор освобождают от грубых обрывков бумаги фильтрацией через ватио-марлевый фильтр, который хорошо отжимают, и еи;е раз фильтруют через фарфоровую свечу. калия. Выпавший в мешке осадок выделяют центрифугированием и растворяют в 50- 100 мл 0,1 М раствора цитрата цатрия. Охлажденный раствор помещают в колбу, добавляют равное ему количество охлажденного хлороформа, погружают колбу наполовину в сосуд с мелко наколотым льдом, осторожно встряхивают 15 мин в шюттель-аппарате и центрифугируют. В центрифужных пробирках смесь разделяется на 3 фазы: солевую верхнюю, гелеобразную среднюю и хлороформную нижнюю. Отсасывают верхнюю солевую фазу и снова добавляют Б колбу равное ей количество хлороформа. Повторяют процедуру встряхивания и отсасывания. Наслаивают солевую фазу на равное количество хлороформа и оставляют в холодильнике на 18 час. Смесь центрифугируют и отсасывают солевую фазу, которую затем подвергают диализу в течение 18 час в растворе 0,850/о-ной поваренной соли и 0,01%ного хлористого кальция. В диализующемся растворе (в мешке) осадок не должен образовываться. К раствору добавляют СХ-цолисахарид, предварительно растворенный в небольшом объеме физиологического раствора (до финальной концентрации 0,15 мг/лгл), и ломещают его в термостат цри на 2 час, а затем в холодильиик на 12-18 час. После этого раствор центрифугируют. Осадок промывают три раза раствором 0,85%-ной цоваренной соли и 0,01 /о-ного хлористого кальция, каждый раз разры.хляя стеклянной палочкой. Промытый осадок растворяют в 10-15 мл 0,1 М раствора цитрата натрия. Малые количества нерастворимого материала (если таковой будет) удаляют центрифугированием. Последний раствор содержит очищенный С-реактивный белок и может употребляться для иммунизации. Концентрацию С-реактивного белка в растворе определяют следующим образом: сначала в небольшом объеме раствора (0,2 мл) определяют азот ио Кьельдалю, а затем полученную величину его в милли граммах умножают на коэффициент 7,81. Целесообразно иммунизировать одновременно нескольких кроликов (8-12) весом от 3 до 4,5 кг, которым Вводят внутривенно по 1-1,5 мл раствора С-реактивного белка от 0,5 до 0,75 мг белка при каждой инъекции. Одновременно с первым внутренним введением кролику в несколько симметричных мест ПОД кожу живота вводят 2-3,5 мл полезной эмульсии, содержащей 1 мг С-реактивного белка. Через 7 дней после последнего внутривенного введения антигена кролики тотально обескровливаются из сонной артерии. Сыворотку консервируют мертиолатом 1:10000 и оставляют в холодильнике на 1-2 недели, после чего центрифугируют для удаления выпавшего осадка и сливают в одну посуду до окончания проверки. рующей силы и титра, для чего из раствора С-реактивного белка готовят объемные растворы, чтобы иметь следующие его концентрации в мг/мл: 0,3; 0,1; 0,03; 0,01; 0,001. Реакции преципитации ставят в капиллярах. Максимальной прецицитирующей силой сыворотки будет то наибольщее количество преципитата .в капилляре в миллиметрах, которое образуется в эквивалентной зоне при концентрации С-реактивного белка от 0,1 до 0,03 мг/мл. Допустимой максимальной преципитирующей силой должны считаться пределы от 4 до 8 мм. Для проверки ца отсутствие перекрестных реакций с сыворотками здоровых людей заготовляют лиофилизированную сыворотку от 20 доноров, у которых в день взятия крови измеряют температуру, определяют РОЭ, лейкоцитоз и лейкоцитарную формулу. При наличии любых жалоб на недомогание, повышения температуры или изменения крови доноры от взятия крови отстраняются. В дальнейшем при наличии проверенной иммунной сыворотки прэтив С-реактивного белка, реакция сыворотки донора с ней также должна учитываться. Лиофильная сушка сыворотки здорового донора должна производиться не позже, чем на следуьэщий день после взятия крови. Для постановки реакции лиофилизированные сыворотки разводятся в день исследования и 20 контрольных реакций преципитации с иммунной сывороткой против С-реактивного белка ставятся в капиллярах. При отсутствии положительных реакций сыворотка признается годной к употреблению и разливается во флакончики по 1 мл и снабжается этикеткой: иммунная сь воротка против С-реактивного белка. Титр, дата, серия. Если имеется хотя бы одиа положительная реакция, целесообразно добавление в общий объем антисыворотки сухой нормальной сыворотки по 0,05 г на 1 лы. После экспозиции в термостате при 40°С в течение двух суток антисыворотка освобождается от выпавшего преципитата центрифугированием на больших оборотах, после чего разливается во флаконы. Предмет изобретения 1.Способ определения С-реактивного белка в крови, отличающийся тем, что, в целях улучшения диагностики заболеваний с наличием воспалительных и некротических явлений, С-реак:тивный белок определяют с помощью иммунной сыворотки, полученной путем иммунизации кроликов внутривенно раствором С-реактивного белка, выделенного из цлеврального (или перитонеального) экссудата больных лимфогранзлематозом с использованием для его изоляции СХ-полисахарида. pa на два гнезда, капилляров, штатива для капилляров, Л1икропробирок для центрифуги, штатива к ним, иглы и флакончика с иммунной сывороткой.