Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии, биохимии и касается определения белка в растительно л материале и культурах микроорганизмоа, аыращеииых на средах с лпгноцеллюлозиым субстратом.
Значительную трудность представляет определение белка в таких сложных био/ioгических субстратах, .как лигноцелпюлозосодержаил.ме материалы (опилки, co/iOMs, гузапая, торф и т.д.) м микробная Ёиомасса, выращенная на таких материалах, и содержащая неутилизиронанные целлюлозу, лигнин и продукт их разложения,
В таких Случаях особенно asm-iB пред-, варительная подготовка биологического мотериала.
Целью изобрет ения явлйетея по8ь(шв ние степени очистки пробы и тем самым повышен 1е точности определения s ней белка.
При обработке лмгиоцвл пнзлозмого материала лредл0гаемь м способом обеспечивается отделение белка от нерастворкмого лигноцаллюлозного субстрата, (материала клеточных отенок и других кислштонераст ЕОримых полисахаридов за счет испольаоsaHHvii ,зкстракци14 белкой концвнтрироsai- Hb M раствором трихлоруксг/игой кислоты. (ТХУ).
Прм акетрбкцйи белкОй концйнтрированным раствором ТХУ одмоаременно в. pacTsop переходят нукявиновме Кйслоты, продукты их-шдролиза и другие нызкомопекулярные. азотистйе азщестза. Псюледуюишй разбавление смейя ,{11-к;тиляироеанной
водой в 3-6 рэз-а (до кйнцентрбцки ТХУ а растворе 0,9-1,2 MjnpMB-OAMT к осзжденню белка, S вещества, содержащие небелкоаый азот, (нуклеиновыекислоты и продукты их гидролиза), остаготой а растваре, Такир/. образом, осадок. KOTOpbtfi используетой для дальнейшего определения белка, содержит лишь незначительное колИчестио лигнинр и других сопутствующих примосай, что позволйбтто1и о определить содержение и пробок йигноцеллюлозосодйржащего мзтернала истинного бе/1кй методами, испольауемыми ДЛИ массового анализа, а именно по количеству общего азота и с помощью кумасси G250.
Был проведен поиск оптимальных параметров обработки лигноцеллюлозосодержащего материала для сохранения точиостм метода определения белка, экстрагируемого из этого материала, за истинное содержание белка в пробе лигноцеллюлозосодержащего материала принималось количество белка, олредепенное по сумме амин.окисяот при аминокислотном анзлизе
с обработкой материала по способу-прототипу.
Определение содержания белка биомассы гриОа РЬоПогз tubercuiosa 151, выращонного на опилках, э зависимости от кони.ентрации ТХУ для экстракции белка и нремени экстракции показало, что область оптимэльн 1х параметров для экстракции белка находится о районе 5 м ТХУ и 3 мин
экстра-кции. При уме1-1Ы.ценми взятых интераалов были олределены границы этой области от 4,5 до 5,5 М ТХУ и время экстракции от2,5доЗ,5,м1-тн{табл. 1).
Для поиска оптимальных naparvieTpou
разведений ТХУ - эк прзкта д/uf осаждения белка бь(Я8 ткспековйнв область от 0,5 М до 1,5 М (с 1лнтарэа;гом 0,1 М).
1Лз представлЕннь Х в тдбл,2 данных опрвдаяяли оптимальную область разведения
ТХУ - зкстр8кта.(от 0,9 М д0 1,2 М).
Способ поясн,четея следую1дими примерами.
Во Есех примерах, приведены также результаты определений белка в аналогичных
п|:)СЬйХ с использованием 0 качестве контроля известных способов обработки пробы и измерения количества балка. Во -зсех таблицзк приаедены средние значения из трех параллвл&нык определе - Ий,
Примерь Навеску измельченной лшеничной-солсмы или опилок 100 мг заливают 2 мл 5 М растЕюра трихлоруксусной кислоты и. выдержи ИИ ют на кипящей водяно ване и течение 3 лили. Пробу центрифугируют ТО ими- при оОООд и супернатзнт разбавляют холодной дистиллированной водой до аонечной концентрации трихлоруксусной кислоть( 1 М, охлаждают S течение tS мкп в ледяной бане и
цегприфупфуют при 10ОООд 10 мин. Содержание белка определяют с помоа{ью реактиаа кумассй и по содержанию общего азота,
Результаты представлены в табл, 3.
Г р. и м е р 2, Навйску биомассь( гриба Phoiiota tubarcutosa 151, выращенного на березовых опилках, обрабатывают способом, .описанным в примере 1. но выдержиазют пробу в 4,5 М трихлоруксусной кислоте а течение 2,5 мин на к.-пящей оодлной бане, а супернатант после 1-го центрифугирования разбавляют дистиллированной водой до конечной концентрации ТХУ 0,9 М,
Результаты приведены в табл, А.
П р и м 8 р 3, Масеску биомассы гриба Acremonlum sp. 6202Q, (зыращенного на шиеничной соломе, обрабатывают способом, описзннькм в примере 1, но пробу выдерживают в 5,5 М ТХУ 8 течение 3,5 мин, а
супернатант после 1-го центрифугирования разбавляют дистиллированной водой до конечной концентрации ТХУ 1,2 М.
Результаты приведены в табл. 5.
Таким образом, предлагаемый способ предварительной обработки лигноцёллюлрзосодержащего материала для определения в нем белка позволяет повысить
Содержание белка биомассы гриба Phollota tuberculosa 151, выращенного на опилках, е зависимости от концентрации ТХУ для экстракции белка и времени экстракции (содержание белка в данной биомассе при определении по сумме аминокислот 3,01 %}
точность наиболее быстрых широко применяемых в серийных и единичных анализах методов, т.е. довести ее до уровня, получаемого при использовании наиболее точного из всех известных методов количественного определения .белка.
(56) Термхитарова Н. Г., Шульга А. В. Прикладная биохимия и микробиология. 197-1, т, 10, rvbe, с. 928.
0
Таблица 1
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ идентификации генотипов сорго | 1988 |
|
SU1604273A1 |
| Способ определения эндогенной интоксикации | 1989 |
|
SU1797059A1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ | 2017 |
|
RU2670001C1 |
| Способ выделения гликозаминогликанов из лейкоцитов крови | 1983 |
|
SU1140787A1 |
| Способ определения содержания гидроперекисей липидов в биологических тканях | 1982 |
|
SU1084681A1 |
| Способ определения фракций гидроксипролина в биологическом материале | 2020 |
|
RU2735375C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ПЛАЗМЫ КРОВИ | 2005 |
|
RU2298189C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ПО СОДЕРЖАНИЮ КАРБОНИЛЬНЫХ ГРУПП В ФИБРИНОВОМ СГУСТКЕ | 2014 |
|
RU2595806C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА ЧЕЛОВЕКА | 2004 |
|
RU2274656C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "ИНГИПРОЛ" | 2001 |
|
RU2197252C1 |
Содержание белка биомассы гриба Phollota tubarculosa 151.
выращенного на опилках, в зависимости от расоавления
ТХУ -экстракта дистиллированной водой
Содержание белка в лигноцеллюлозосодержащем материале при определении предлагаемым и известным
способами (содержание белка по
сумме аминокислот : е соломе 0,95%,
в опилках -0,49%)
Таблица 2
15 Таблица
Cfioco5 on 06 дел ем ия
Co/,u px Ri;iu; белк .-. биомассе гриба Phoiiota
tubЭCll o ;a ib1 пр.. определении предлагзеf ;-::Vi 11 1 (;| Hbtisi л гк:обами (с9дер;-ка ие
6(гЛКа r:f cy:v;Mf; i-f iiiiOKHC/IOT 3,01 %)
G no ;i ihii:i K/M;;.;:ti Г ро/1 :г;г;к;:--1,;; nnnc-Mi oHn,-;()OTiji
Продолжение табл.3.
,%
Т а б л ( ц а А
2,00
1ч:св Acrensoniurn sp. i)u,i,/isr8SMfc i« и .19 белка по лот 4,25%)
Формула изобретения
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 8 НЕМ БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы и нагревание ее в растворе трихлоруксусной кислоты на кипящей во/ц|н6й бане с прслв; дующим центрифугирование и выделением супернатанта, отличающийся Тем, что, с целью повышения степени очистки пробы
и тем самым повышения точности определения в ней белка, концентрацию раствора трихлоруксусной кислоты выбирают в пределах 4,5 - 5,5 М, нагревание ведут в течение 2,5-3,5 мин и выделенный при центрифугировании супернатант разбавляют дистиллированной водой до конечной концентрации трихлоруксусной кислоты 0,9 -1,2 М с последующим повторным центрифугированием для выделения белоксрдержащего осадка.
