Способ определения содержания гидроперекисей липидов в биологических тканях Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

эо

1

б:

00 Изобретение относится к медицине точнее к биохимическим исследованиям и может быть исгользовано лри определении содержания гидроперекисей ли нидов в различных биологических тканях. Свободнорадикальное, перекисное окисление липидов тканей играет важную роль в регуляции нормальных мета болических процессов и в механизме развития целого ряда патологических состояний. Для получения полного представления о кинетике перекисного окисления липидов в тканях животных и человека определяют фракции перекисей липидов в зависимости от этапов их образовав кия - диеновую коньюгацию ненасыщенных высших жирных кислот, появляющую ся на начальных этапах липопереокисления, гидроперекиси липидов, обнаруживаемых на .более поздних этапах перекисного окисления липидов и, наконец, малоновый диальдегид - один из наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов l Известен способ определения гидро перекисей липидов путем прямого гистохроматографического определения в животных тканях 2 . Однако известный способ, несмотря на более высокую чувствительность, остается трудоемким (приготовление срезов тканей на замораживающем микротоме, нанесение образцов на пласти ны, экстракция и разделение перекисей липидов в специальной герметичной камере с углекислотой -в постоянном восходящем потоке растворителя и т.д.) и очень длительным по выполнению (определение у 2-х животных 4 образца тканей, 8-10 пластин занимает световой день). Способ может быть использован тол ко для специальных научных исследова ний , когда идентификацию гидропереки сей липидов требуется определить in vivo. Известен способ определения гидро перекисей липидов методом полярографической регистрации, основанной на выявлении характеристики потенциала полуволны липрперекисей по поляризационным кривым сила тока. - потенциал Однако данный способ, несмотря на меньшую длительность его осуществления по сравнению с предыдущими способами, является сложным и трудоемким. Точность способа зависит от предварительной экстракции липидов из биологического материала и от качества препаративного иk разделения. Поэтому способ может быть использован в специальных научных исследованиях, цель которых идентифика ия фракционйо1 0 состава продуктов перекисного йкисления полиненасыщенных : сирнйх кислот. Реализация способа .требует сложного биохимического оборудования, а именно наличия электронных полярографов (типа LP-60,LP-7, L Р-7Е), специальных герметических электролизеров с приспособлением для продувки аргоном и т.д. Известен способ определения гидроперекисей липидов и биологических тканях путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой и последующим воздействием на исследуемый материал растворами соляной кислоты, соли Мора, тиоцианата аммония и спектрофотометрическим измерением продуктов реакции з . Однако данный способ является недостаточно чувствительным. В ходе осуществления способа взаимодействие реактивов происходит с заниженным количеством гидроперекисей липидов, так как добавление к биологическому материалу трихлоруксусной кислоты с конечной концентрацией в растворе 5% приводит к осаждению не только белка, но и липидов, входящих в состав липопротеидных комплексов. , Отсутствие в способе единого объекта (экстракта липидов) для одновременного определения липидов и их гидроперекисей делает невозможным исследования достоверного соотношения липидов и их гидроперекисей (содержание гидроперекисей в единице липидов) , что является основным показателем гидроперекисей липидов. Это связано с влиянием погрешностей двух методик на конечный результат,когда вместо очищенного липидного экстракта (объекта исследования) берут цельную биологическую ткань. Кроме того, использование известного способа требует большого количества исследуемого биологического материала ( 2,0 мл). Приведенные недостатки снижают возможность применения известного способа как для дифференциальной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, так и в биохимических экспериментальных исследованиях. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Поставленная цель достигается согласно способу определения содержания гидроперекисей липидов в биологических тканях путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой о последующим воздействием на исследуемый материал тиоцианатом аммония и спектрофотометрией, при котором предварительно проводят экстракцию липидов этанолом в соотношении (13:1)(16:1) к исследуемому материалу с последующим встряхиванием смеси в течение 5-6 мин. Способ осуществляют следующим образом. Забор ткани и приготовление образ цов для экстрагирования проводят при температуре 4°С. 0,2 мл плазмы крови, содержащей 0,5 мг/мл оксалат натрия или другого биологического материала в буферном растворе с рН 7,4 (тканевой гомогенат или митохонд риальная фракция с концентрацией бел ка 10-16 мг на пробу),.помещают в центрифужную пробирку с хорошо фикси руемой пробкой, добавляют 2,8 мл этанола и 0,05 мл 50%-ного раствора ТХУ. Закрьшают пробирку пробкой и интенси-вно встряхивают в течение 5-6 мин. Образующийся белковый осадо отделяют Центрифугированием (ю мин при 3000 об/мин). Полученный супернатант, представляющий собой этанольный экстракт липидов, используют как объект для определения гидроперекисей липидов и общих липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты. Гидроперекиси липидов определяют следующим образом. мл этанольного экстракта доводят этанолом до 2,7 мл, встряхивают и добавляют 0,02 мл концентрированной НСб и 0,03 мл 1%-ного.раствора соли Мора в 3%-ом растворе НСЕ. Интенсивно встряхивают и точно через 30 с приливгиот 0,2 мл 20%-ного раствора тио цианата аммония, после чего развива ется малиновая окраска. Измерение оптической плотности производят в течение 10 мин после добавления тио цианата аммония на серийном спектро фотометре при длине волны 480 нм ход с луча в кювете 10 мм) Контрольную пробу ставят как опытную, но вместо плазмы крови берут 0,2 мл НлО bidest. ВеличинадД о, обусловленная содержанием гидроперекисе липидов, равна разности между значе ниями опытной и контрольной проб. (гидроперекиси липидов) 480 (опыт) -Дцбо (контроль).. Общие липиды определяют следующи образом. 0,75 мл оставшегося суперн танта выпаривают на водяной бане, и добавляют к осадку 2,5 мл концент рированной . Тщательно перемешивают содержимое и помещают в киПя щую баню на 10 мин. После охлаждения под водопроводной водой к Ол4мл отобранной смеси добавляют 2,8мЛ фосфатно-ванилинового реактива (4 ч. концентрированной смешивают с 1 ч. 0,6%-ного раствора ванилина), тщательно перемешивают и оставляют на 45 мин при комнатной температуре./Экстинкцию изме ряют на фотоэлектрокалориметре при зеленом светофильтре (длина волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 5 мм против, контрольной пробы. При использовании спектрофотометра измерение проводят при длине волны 530 нм. В контроле вместо этанольного экстракта берут этанол. Расчет производят .по калибровочному графику или по стандарту, в качестве которого используют троолеин. Содержание гидроперекисей липидов в биологическом материале выражают в величина} оптической плотности при 30 нм на 1 мл плазмы крови дД48о /мл плазмы) или на 1 г ткани (дД48о / тканиЧ , а также на 1 мг липидов ( /мг липидов). Пример. Определено содержание гидроперекисей липидов в плазме крови у здорового мужчины К., 30 лет. Гидроперекиси липидов 0,265 (.ьД48о плазмы) и 0,056 Сд / липидов). Общие липиды 4,70 г/л. П р и м ер 2. Определено содержание гидроперекисей липидов в плазме крови у больного Ш., мужчины, 55 лет. Диагноз: НБС. Стенокардия напряжения и покоя. Атеросклеротический кардиосклероз с блокадой левой ножки пучка Гиса. Атеросклероз аорты, коронарных артерий. Нд. Гидроперекиси липидов 0,352 (tt J giO/мл плазмы) и 0,057 С ь Д4во/Ml липидов). Общие липиды 5,23 г/л. П р и м е р 3. Определено содержание гидроперекисей липидов в плазме крови у больного В., мужчины; 53 лет. Диагноз: ИБС. Острый период трансмурального передне-верхушечного инфаркта миокарда левого желудочка с вовлечением боковой стенки. Атеросклероз аорты, коронарных артерий. Н,. Гидроперекиси липидов 0,416 ЛД480/МЛ плазмы) и 0,060 (& Д 1йо/мг липидов). Общие липиды 6,92 г/л. Всего обследовано 20 здоровых мужчин в возрасте от 26 до 50 лет, 32 больных ишемической болезнью сердца, мужчины в возрасте от 29 до 62 лет и 29 больных в остром периоде инфаркта миокарда, мужчины в. возрасте 38-60 лет. Результаты исследования представлены в таблице 1. П р и м е р 4. Исследована динамика содержания гидроперекисей липидов в интактной митохондриальной фракции и фракции митохондрий, инкубированной при в присутствии 0„1 мМ FeS04, что приводило к интенсификации перекисного окисления липидов в начале инкубации, а через 10 мин к его торможению. Результаты исследований приведены в табл. 2. Этанол действует как детергент и как экстрагирующий органический растворитель. Присутствие в этаноле трихлоруксусной кислоты способствует усилению разрыва липид - белковых

связей, что увеличивает степень экстракции гидроперекисей липидов.

Результаты опытов приведены в табл. 3.

Встряхиванием смеси биологического материала, этанола и трихлоруксу ной кислоты (.ТХУ) в течение 5 мин и более приводит к максимальной экстракции гидроперекисей липидов.

В табл. 4 приведена зависимость экстракции гидроперекисей липидов от времени.

Наличие нелипкдных примесей в этанольном экстракте, таких как сахра и аминокислоты, не мешает определению содержания гидроперекисей липидов, так как они вступают в реакцию с солями металлов преимущественно при смещении рН в щелочную сторону. .

Проведена этанольная экстракция растворов глюкозы в воде с концентрациями 60,600 мг % ги шнокислот цистеина и триптофгша с концентрациями 2,20,200 мг% предлагаемым способом.

После добавления растворов соляной кислоты, соли Мора и тиоцианата аммония оптическая плотность по сравнению с контролем была равна нулю. Следовательно, даже увеличение содержания глюкозы и аминокислот в биологических тканях на один или два порядка не отражается -на определении гидроперекисей в липидных экстрактах получаемых по предлагаемому способу.

Таким образом, в предлагаемом способе определения гидроперекисей липидов в биологических тканях чувствительность по сравнению с прототипом возрасла на 42-49% (табл. 3). Способ позволяет более точно определить соотношение гидроперекисей и общих липидов, требует меньшего объема исследуемого биологического материала (в 5-10 раз).

Предлагаемый способ обеспечивает Ьысокую чувствительность, хорошую воспроизводимость, а также быстр и прост в осуществлении.

Таблица

спех:ов ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой с последующим воздействием на исследуекш1й материал тиоцианатом аммония и спектрофотометрией, о т л и ч a ющ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, предварительно проводят экстракцию липидов этанолом в соотношении Cl3:l)

Гидроперекиси липидов

( )

0,2704-0,016

Время инкубации при 37 С в присутствии 0,1 мМ PfeSOjj , мин

fto Величины представляют собой среднее опытов.

0,345+0,028

0,405+0,025

Таблица2

О5101530

0,038 0,098 0,151 О,101 0,066 арифметическое пяти параллельных Показатели 48o (прототип) ЛДцдО (этанол) (этанол+ТХУ) . этанол ) Гд, Ьху) ЛДлйо t этанол+ТХУ) .2.° % .., Время экстрагирования. .„„..::„. 1 5 . 10 ТаблицаЗ Пробы |ГI 1 ..L.J.....iL..J.....J...... 0,190 0,175 0,180 0,195 0,204 0,255 0,240 0,240 0,245 0,265 0,270 0,255 0,265 0,290 0,295 3 ° 142146147149145 Таблица4 Пробы пппии: 0,235 0,220 0,234 0,215 0,2400,260 0,285 0,275 0,275 0,280 0,265 0,285 0,270 0,275 0,280