Способ изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови Советский патент 1986 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине а именно к способам изготовления ин дикаторных полос для количественног определения глюкозы в крови. Цель изобретения - упрощение спо соба и повышение качества индикатор ного слоя полос. Цель достигается тем, что вместо желатины используется один или несколько синтетических полимеров в ви де растворов или дисперсий, при изготовлении индикаторных полос не требуется термостатирования наносимого состава, сушка индикаторной полосы занимает 1,5-2 ч. Способ осуществляют следующим об разом. Наносят на полимерную подложку индикаторного слоя, включающего впи тывающую целлюлозную основу (в том числе модифицированну о катионообмен ную целлюлозу), глюкозооксидазу, пероксидазу, хромогенный реагент 0-толидин, с последующей су1акой сло или отверждением и нарезкой. При этом вместо желатины используют оди или несколько синтетических или искусственных полимеров в виде растворов иди дисперсий. Пример 1. Бумагу карбоксиметилцеллюлозную пропитывают 1%-ным раствором о-толидина в этиловом спирте и высушивают при комнатной температуре 20-30 мин. Готовят смес следующего состава: Вода55 1л Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl, et Bilai 0,16 г Пероксидаза0,OA г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5)4,8 мл Смесь при комнатной температуре перемешивают с помощью стеклянной палочки или магнитной мешалки в течение 5-7 мин, В результате должен получиться гомогенный раствор желтовато-коричневого оттенка, который характеризуется плотностью р 1,015 г/см и вязкостью 2 1,02сП Наносят смеоь на карбоксиметилцеллю лозную бумагу, предйарительно обработанную раствором о-толидина. После высушивания при комнатной температуре в течение 40-60 мин полоса пропитывается в 0,3%-ном растворе триацетатцеллюлозы в дисксане при оотношении пропиточного раствора к умаге 0,7-1,0 г на. 100 см. 0,3%-ный раствор триацетатцеллюозы в диоксане готовят при комнатой температуре растворением 0,9 г . елко нарезанной триацетатцеллюлозной пленки в 300 см диоксана, предварительно перегнанного над металлическим натрием. Получаемый раствор характеризуется плотностью iP 1,035 г/см и вязкостью 2,1 02 сП. Полученную индикаторную бумагу высушивают в течение 20 мин при комнатной температуре, наклеивают на полимерную основу с помощью двухсторонней липкой ленты и разрезают на полосы необходимых размеров. Индикаторная зона полученных полос в исходном состоянии имеет белый цвет с кремовым оттенком. Коэффициент отра кения полос в области 600 нм равен 61-63%. После контакта в течение 1 мик с кровью, содержащей глюкозу, и последующего смывания крови водой индикаторный слой приобретает голубую окраску. При концентрации глюкозы в крови 5,5 ммоль/л коэффициент отражения полос 44%. При концентрации глюкозы в крови 11,2 ммоль/л коэффициент отражения полос 37%. Окраска устанавливается сразу после смывания пробы и сохраняется в течение по крайней мере 20 мин. Пример .2. Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают 2%-ным раствором триацетатцеллюлозы в смешанном растворителе ацетон - диоксан при расходе пропитывающего раствора 1,0-1,5 г на 100см бумаги, 2%-ный раствор триацетатцеллюлозы готовят растворением при комнатной температуре 6 г мелко нарезанной триацетатцеллюлозной пленки в 300 см смеси диоксана с ацетоном, взятых в объемном соотношении 1:1 (диоксан предварительно перегоняется над металлическим натрием), Получаемый раствор характеризуется плотностью р 0,9248 г/см и вязкостью ° 13,32 сП, После высушивания в течение 10 мин при 50 С бумагу пропитывают в смеси еледующего состава: Вода84 мл Глюкозооксидаза из Penicilliiim vitale Pidopl. et Bilai . 0,4 г Пероксидаза0,1 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5)12 мл Иоливинилацетат (50%-ная водная дисперсия) .19 г 9-тоЛИДИИ (1%-ный раствор в этаноле) 58 мл Смесь, содержащую указанные ком поненты, перемешивают с помощью стёклянной палочки или магнитной ме шалки при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Получаемая смесь должна представлять собой однородну эмульсию кремового цвета, которая характеризуется плотностью р 0,9846 г/см и вязкостью 2 5,25 сП Смесь наносят в количестве 3,03,5 г на 100 см бумаги. После высу шивания в течение 15-20 мин при 50 получается индикаторная лента кремо вого цвета, которую наклеивают на подложку с помощью двусторонней лип кой ленты и нарезают на полосы. Пос ле контакта с кровью в течение 1 мин и смывания крови водой полосы окрашиваются в голубой цвет. Зависимост интенсивности окраски от концентрации глюкозы в крови (коэффициент от ражения Т при нм) показана в табл. 1 Интенсивность окраски полос уста навливается в течение 1 мин и не ме няется по крайней мере в течение 30 мин. Пример 3. 50 г порошковой карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают 150 мл 1%-ного раствора о-толидина в этиловом спирте, перемешивая до полного удаления растворителя. Пропитку порошковой карооксиметилцеллкшозы этанольным раствором о-толидина проводят под вытяжкой пр комнатной температуре путем перемешивания стеклянной палочкой смеси карбоксиметилцеллюлозы с раствором о-толидина до полной ее однородност Перемешивание (под вытяжкой) продол жают на водяной бане при 50°С в широкой фарфоровой чашке в течение 20 30 мин до получения сухого однородного порошка кремового цвета. Получается носитель с хромагенным реагентом. Готовят смесь следующего состава: Вода50 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl et Bilai0,4 г Пероксидаза0,1 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) 12 мл Поливинилацетат (50% водная дисперсия) 50 г Носитель с хромогенным реагентом20 г Смесь, содержащую указанные компоненты, перемешивают стеклянной палочкорЧ или магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 1015 мин. В результате должна получиться однородная паста кремового цвета, характеризуемая плотностью р 1,173 г/см . и вязкостью 20 П. Полученную пасту при комнатной температуре наносят через фильеру или с помощью кисти - на активированную полимерную подложку. Смесь тщательно перемешивают и наносят на активированную полимерную подложку в количестве 6-7 г на 100 см подложки, сушат при комнатной температуре в течение I ,5-2 ч и нарезают на полосы. Активированную полимерную подложку получают путем погружения триацетатцеллюлозной пленки в ванну с 30%ным раствором щелочи (гидроокиси натрия) при 50 С на 10 мин. После щелочной обработки пленку промывают водопроводной водой в течение 10 мин при 15-20°С до нейтральной реакции промывной воды, а затем прополаскивают в течение 2-3 мин в дистиллированной воде. Промытую активированную полимерную подложку сушат при комнатной температуре 30-40 мин. Полученная пленка отличается от обычной исходной триацетатцеллюлозной подожки слабым матовым налетом. Индикаторная зона полос в исходном состоянии имеет кремовую окраску. При контакте с кровью в течение 1 мин и последующем смывании крови водой полосы приобретают голубой вет, интенсивность которого возрастает с ростом концентрации глюкозы в крови. Результаты испытаний приведены в табл. 2 . Интенсивность окраски полос станавливается спустя 1 мин после смывания крови и сохраняется постоянной по крайней мере в течение 30 мин Пример 4. Фосфатцеллюлозную бумагу пропитывают 1%-ным раствором этилцеллюлозы. 1%-ный раствором этилцеллюлозы получают растворением 2 г порошковой этилцеллюлозы в 200 см смеси толуо ла и этанола, взятых в объемном соотношении 1:1. Раствор характеризуется р 0,832 г/см% 0,893 сП. Этим раствором пропитывают фосфатцеллюлозную бумагу при соотношении 1,5-2,0 г указанного раствора на 100 см бумаги. Высушивают при 50 С в течение 10 мин. Полученную бумагу пропитыва зт 1% ным раствором S-толидина в этаноле при соотношении0,7-1,0 г раствора на 100см бумаги,высушивают при 3(fc в течение 15 мин.На полученную бумагу на носят смесь следукицего состава. Глюкозооксидаза из Penicillium vitale , Pidopl. at Bilai0,2 г I Пероксидаза0,015 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5)10 м;г1 Поливинилацетат (50% водная дисперсия) 22 г Смесь, содержащую указанные компоненты, при комнатной температуре перемешивают стеклянной палочкой или с помощью магнитной мешалки в течение 5-7 мин, В результате должна по лучиться однородная эмульсия кремового двеta, которая характеризуется плотностью 1,038 г/см и вязкостью г 2,957 сП. Соотношение смеси к бумаге 1,01,5 г на Ч 00 см. После сушки в течение 40 мин при комнатной темпера- туре получают индакаторнуто бумагу кремового цвета, iq TopyTO наклеивают с помощью двусторонней липкой ленты на полимерную подложку и нарезают на отдельные полосы. При контакте с кровью в течение 1 мин и последукнцем смывано1И крови водой коэ)фициент отражения полученных полос при нм изменяется в зависимости от концентрации глюкозы в крови, Зависимость коэффициента отражения полос от концентрации глюкозы в крови дана в табл. 3. 1 1. « Пример 5. Фосфатцеллюлозную бумагу пропиташают 1%-ным раствором омыленного сополимера винилхлорида с винилацетатом А-13-0 в ацетоне при i соотношении 1,5-2,0 г раствора на 100 см бумаги, высушивают в течение 10 мин при. 50с. 1%-ный раствор О1чьшенного сополимера винилхлорида с винилацетатом А-15-О готовят растворением при комнатной температуре 2 г сополимера в 200 см ацетона. Полученный раствор характеризуется плотностью р 0,7895 г/см и вязкостью 2 0,547 СП. Полученную бумагу пропитывают 1%нь М раствором о -толидина в этаноле при соотношении 0,7-1,0 г раствора на 100 см бумаги, сушат при 50°С в течение 10 мин. На полученную бумагу. наносят смесь, coдepжaп yю ферменты, Поливинилацетат и буфер, как в примере 4. После высушивания при 50 С в течение 20 мин полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. Аналитические характеристики пол 1аемых таким образом полос выражаются следующей зависимостью коэффициента отражения полос от концентрации глюкозы в крови, которая представлена в табл, 4. Окраска устанавливается через 1-2 мин после смывания пробы крови и сохраняется постоянной по крайней мере в течение 30 . Пример 6. Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают 2%-нь М раствором уретанового каучука в ЭТИЛацетате при соотношении 1,01,5 г раствора на 100 см бумаги, высушивают при комнатной температуре в течение 30 мин. 2%-ный раствор каучука готовят растворением при комнатной температуре 4 г мелко нарезанного каучука в 200 см этилацетата. Получаемый раствор характеризуется плотностью 0,897 г/см и вязкостью f 0,772 сП. На полученную бумагу наносят смесь следующего состава: Вода84 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl. et Bilai 0,4 г Пероксидаза0,1 г 7 Фосфатный буфер 2М (рн5,5) Поливинилацетат (50%-ная водная дисперсия) О-толидин (1%-ный раствор в этаноле) 58 мл Смесь готовят как в примере 2. При контакте полос с кровью в т чение 1 мин и последующем смывании крови коэффициент отра: сения полос области 7i 600 нм зависящий от кон. центрации глюкозы в крови, предста : лен в табл. 5. Интенсивность окраски полос не меняется по крайней мере в течение 30 мин после смывания пробы. Пример 7. Бумагу карбокси метилцеллюлозную пропитывают 2%-ны раствором нитрильного каучука в ме тилэтилкетоне при соотношении 1-01,5 г раствора на 100 см бумаги, высушивают при комнатной температу ре в течение 30 мин. Для приготовления 2%-ного раство ра каучука А г мелко нарезанного каучука растворяют при комнатной температуре в 200 см метилэтипкето на. Получаемый раствор характеризуется плотностью р 0,806 г/см и вязкостью 2 0,718 сП. Затем пропитывают 1%-ным раствором О-толидина в этаноле при соотно шении: 0,7-1,0 г раствора на 100 см бумаги, сушат при комнатной темпера туре 20-30 мин. На полученную бумагу наносят сме следукядего состава: Вода60 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl. et Bilai 0,2 г Пероксидаза0,05 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5)10 мл Поливинипацетат (50%-ная водная дисперсия)22 г Смесь готовят как в примере 4. Наносимый состав и пропитываемую бумагу берут в соотношении: 0,8-1,2 смеси на 100 см бумаги. После сушк при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч индикаторную бумагу кремово го цвета наклеивают на подложку и нарезают как и в предыдущих примера При контакте с кровью в течение 1 мин и последующем смывании водой 218 голубая окраска полос (Т приЛ 60бнм) зависит от концентрации глюко.зы в крови следующим образом. Результаты испытаний даны в табл. 6. Окраска полос стабильна в течение 20-30 мин. Пример 8. Бумагу карбоксиметилцеллюлрзную пропитывают 1%-ным раствором б-толидина при соотношении 1,0-1,5 г раствора на 100 см бумаги, высушивают при в течение 15 мин, после на нее наносят смесь следующего состава: Вода55 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitalle Pidopl. et Bilai 0,16 г Пероксидаза0,04 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5)4,8 мл Смесь готовят как в примере 1. Смесь наносят при соотношении 1,0-1,5 г на 100 см бумаги. После сушки при 50 С в течение 20 мин полученную бумагу пропитывают О,1%ным раствором ацетобутиратцеллюлозы в этилацетате при соотношении 0,81,2 г раствора на 100 см бумаги, 1%-ный раствор ацетобутиратцеллюлозы готовят растворением при комнатной температуре 0,2 г порошкообразного полимера в 200 см этилацетата. Получаемый раствор характеризуется плотностью р 0,891 г/см и вязкостью 2 0,668 сП. Индикаторную бумагу сушат при комнатной температуре в течение 20 мин, наклеивают на подложку и нарезают на полосы. При контакте с кровью в течение 1 мин и последующем смывании крови водой интенсивность окраски полос (т при51 600 нм) зависит от концент рации глюкозы. Результаты испытаний даны в табл. 7. Окраска полос сохраняется постоянной в течение 20-30 мин. Сравнительная характеристика предлагаемого способа изготовления ндикаторных полос для определения глюкозы в крови и известного привеены в табл. 8. Зависимость коэффициента отражеия (%} индикаторных полос от времеи, прошедшего после смывания крови. показана в табл. 9Двремя контакта с 60 с., Сг, мг%). Формула изобретения 1. Способ изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови, включающий нанесение на полимерную подложку индикаторного слоя, в состав которого входят целлюлозная основа, выполненная в виде бумажной ленты либо в виде порошка, глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl et Bilai, пероксидаза, хромогенный реагент о-толидин, буфер и связывающий компонент с последующим высушиванием слоя или его отверждением и нарезкой, отличающий с я тем, что, с целью упрощения способа и повьшения качества индикаторного слоя полос, в качестве г

гдюкоэм

ммоль/лО 4,4 13,3 21,6

,1%69 44 3227 21

ГЯЮ1«ЧМ

ммоль/лО 2,8 6,7 15.,О 22,8

Т,| %63 52 4130 23 оказателиПроба Цельная кровь глюкоэм ммоль/л 2,8 5,0 7,8 63 58 -52 Сухая полоса Т-70% Полоса, смоченная водой 1

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3 21 связывакяцего компонента в индикаторный слой вводят один или несколько синтетических и (или) искусственных полимеров, при этом используют растворы полимеров в органических раст- . ворителях. 2, Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что в качестве синтетических полимеров используют поливинилацетат, нитрильный каучук, уретановый каучук, омыленный сополимер винилхлорида с винилацетатом. 3, Способ по пп. 1 и 2, о т л ичающийся тем, что используют дисперсию поливинилацетата в воде. 4, Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве искусственных полимеров используют триацетатцеллюлозу, этилцеллюлозу, ацетобутиратцеллкшозу. 11,7 16,1 23,3 47 41 36 П1269021 Показатели Цельная кровь Cf,«KO,b, . ммоль/л 3,9 Т, %61 Сухая полоса Полоса, смоченная водойТ 68% Показатели Цельная кровь Сглкжозы , ммоль/л 3,3 6, Т, % 47 38 Сухая полосаТ 68% Полоса, смоченная водойТ 69% -глюкозы ммоль/лО 6,1 10,5 Т, %68 4841

О 5,0 10,0 13,9 21,0 70 5851о 4640 Т 12 Таблица А Проба 8,3 14,5 21,1 0 41 36 Таблица 5 Проба 12,8 18,9 23,3 27 22 19 Таблица 6 15,5 20,0 22;2 3733З. - IIII блица 7 Время сушки бумажной лбнты после нанесения индикаторного состава, Температура наносимого состава, С Необходимость в термоОбязательно, постатировании при нанескольку вязкость наносимого соста сении индикта торного зависит от темпе состава туры

Коэффициент отражения, %, после

Способ

О I 0,5 1 . .5 2 I 2,5 40-45

ТаблицаЭ смывания крови, мин 1,5-2,0 10-60 Не надо, вязкость наносимого состава практически не зависит от температуры

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови. Цель изобретения - упрощение способа и повышение качества индикаторного слоя полос. .Форфатцеллюлозную бумагу пропитывают 1%-ным раствором оьлшениого сополимера винилхлорида с винилацетатом в ацетоне и высушивают. Полученную бумагу пропитывают раствором о-толидина в этаноле и сушат. На полученi ную бумагу наносят смесь, содержащую (Л ферменты, поливинилацетат и буфер. После высушивания полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. 3 з.п. ф-лы, 9 табл. to Од СО О ю