ШТАММ PENICILLIUM FUNICULOSUM КМ МГУ 433-ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/14 C12N9/04 C12N9/04 C12R1/80 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и пищевой промышленности, а именно к способу получения фермента глюкозооксидазы. Глюкозооксидаза широко применяется в медицинской диагностике для определения содержания глюкозы в крови, а также в пищевой промышленности для удаления остатков кислорода в соках, пиве и герметически запакованных пищевых продуктах. Наличие примесей кислорода вызывает порчу их при хранении.

Известны продуценты внеклеточной глюкозооксидазы из грибов рода Penicillium.

В авторском свидетельстве N 237 080 (1969 г.) описан штамм Penicillium vitale Pidopi. et Bilai и способ получения глюкозооксидазы путем культивирования его на питательной среде, содержащей 0,5 - 0,7% кукурузного экстракта, 2% сахарозы и 0,2% нитрата калия. При этом получен выход глюкозооксидазы 80 - 100 ед/мл.

Ввиду большой практической значимости глюкозооксидазы в разных странах ведутся поиски продуцентов глюкозооксидазы. Так, итальянскими исследователями в качестве перспективного продуцента глюкозооксидазы отобран штамм Penicillium variabile P16 и разработан способ получения глюкозооксидазы путем культивирования его на подобранной авторами среде с 8% глюкозы, 0,3% пептона, 0,5% нитрата натрия, фосфатами и мелом. Получено глюкозооксидазы 15 ед/мл (J. Appl. Bacter. 1993. V. 75 P. 369-372; Biotechnol. Appl. Biochem. 1995. V. 22. P. 169 - 178).

В качестве прототипа следует принять штамм Penicillium funiculosum Г-15 и способ получения глюкозооксидазы путем культивирования его на среде, содержащей (в %): сахарозу - 6,0, KNO₃ - 0,8, KH₂PO₄ - 0,1, MgSO₄ - 0,05, KCl - 0,05, FeSO₄ • 7H₂O - 0,00005, MnSO₄ • 5H₂O - 0,00026, CaCO₃ - 2,0, твин 85 - 0,3, гидрол - 0,1, экстракт солодовых ростков - 1,0, позволяющий получить глюкозооксидазу в количестве 20 ед/мл. (Михайлова Р.В., Шишко Ж.Ф., Ясенко М. И. "Влияние компонентов питательной среды на образование внеклеточной глюкозооксидазы Penicillium funiculosum Г-15". Весцi АН Беларусi. Сер. биолог. 1998. N 2. С. 57-60).

Недостатками прототипа являются использование в среде экстракта солодовых ростков - компонента неопределенного состава и низкий выход фермента.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода глюкозооксидазы и разработка стандартных условий для его обеспечения.

Задача решается
1) с помощью использования вновь выделенного авторами штамма Penicillium funiculosum KM МГУ 433 - продуцента глюкозооксидазы, способного синтезировать глюкозооксидазу в отсутствие комплексных органических веществ неопределенного состава;
2) разработкой нового способа получения внеклеточной глюкозооксидазы, предусматривающего культивирование продуцирующего микроорганизма Penicillium funiculosum на питательной среде, содержащей сахарозу, нитрат калия, дигидрофосфат калия, сульфат магния, источники микроэлементов - сульфат марганца и дистиллированную воду, отличающегося тем, что в среду дополнительно вводят гидрофосфат калия, из источников микроэлементов используют сульфаты цинка и меди (II), хлорид кобальта, молибдат натрия и борную кислоту, при следующем с соотношении компонентов, мас.% (в пересчете на кристаллогидратные формы солей):
Сахароза - 8,0-12,0
Нитрат калия - 1,0-4,0
Дигидрофосфат калия - 0,15-0,4
Гидрофосфат калия - 0,15-0,4
Сульфат магния - 0,05
Вода дистиллированная - Остальное
с добавлением микроэлементов, мг•мас. % (в пересчете на кристаллогидратные формы солей):
Cульфат цинка - 0,4-1,0
Сульфат меди (II) - 0,02-0,1
Сульфат марганца - 0,5-3,0
Хлорид кобальта - 0,04-0,1
Молибдат натрия - 0,02-0,1
Борная кислота - 0,4-1.0
Выделение глюкозооксидазы из культуральной жидкости ведется известными методами с помощью осаждения фермента сульфатом аммония, дальнейшей очистки на сефадексе и лофилизации ОЖ. Прикл. биох. и микроб. 1978, т. 14, N 3, с. 377-382; Biotechnol. Appl. Siochem. 1995, v. 22, p. 169-178).

Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 отселекционирован М.Б. Куплетской как более активный по синтезу глюкозооксидазы клон из исходного штамма Penicillium funiculosum, который был выделен А.В. Кураковым в 1988 г. с пораженной грибами краски.

Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 принадлежит к секции Biverticillat symmetrica. Конидии расположены на воздушных грифах, короткие, несут двухъярусные симметричные кисточки. Конидии овальные. Является аэробным организмом, не патогенен. Для поддержания штамма наилучшей средой является сусло-агар 4-5^o Баллинга с начальным pH 6-6,2. Температура выращивания 25-26^oC. На сусло-агаре образует плотный налет белого мицелия, поверхность которого по мере спорообразования приобретает серо-зеленую окраску. Для лучшего спорообразования необходим рассеянный свет.

Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 является продуцентом глюкозооксидазы. Он способен синтезировать глюкозооксидазу на простой синтетической среде, не содержащей комплексных органических веществ непосредственного состава.

Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 депонирован в коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии биологического факультета Московского государственного университета под номером 433.

Пример 1
Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 выращивают на питательной среде состава (в %):
Сахароза - 12,0
KHO₃ - 3,0
KH₂PO₄ - 0,15
K₂HPO₄ • 3H₂O - 0,25
MgSO₄ • 7H₂O - 0,05
Водопроводная вода - Остальное
Начальные pH - 6,9
Среду разливают по 50 мл в конические колбы объемом 750 мл.

Стерилизуют при 1 атм.

Посевной материал выращивают в пробирках скошенного сусло-агара 4-5^o Баллинга. Засев производят спорами гриба, используя хорошо заспоровавшуюся культуру 3-8 недельного возраста. Споры смывают с поверхности агара стерильным 0,1 М фосфатным буфером, приготовленным на дистиллированной воде. Засеянные колбы выращивают на качалке с 180 об/или при 15-26^oC.

Спустя 5 суток мицелий отделяют от среды фильтрованием через бумажный фильтр. В фильтрате определяют количество глюкозооксидазы колориметрическим методом с о-дианизидином по методике, описанной в руководстве "Methods of enzymatic analysis". Ed. H.U. Bergmeyer. 1974. New York. London. P. 457-458.

За 1 единицу глюкозооксидазы принимается то количество фермента, которое разлагает 1 микромоль D-глюкозы за 1 мин. при pH 7 и 25^oC.

В культуральной жидкости обнаруживают глюкозооксидазу в количестве 30 - 35 ед/мл.

При замене в вышеуказанной среде водопроводной воды на дистиллированную выход глюкозооксидазы составляет всего 1 - 2 ед/мл. Это свидетельствует о необходимости микроэлементов для синтеза глюкозооксидазы.

Пример 2
Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 выращивают по примеру 1, но используют питательную среду, приготовленную на дистиллированной воде, следующего состава (в %):
Сахароза - 8,0
KNO₃ - 3,0
KH₂PO₄ - 0,15
K₂HPO₄ • 3H₂O - 0,25
MgSO₄ • 7H₂O - 0,05
Дистиллированная вода
Начальный pH - 6,9
Среду используют с добавлением микроэлементов в различных сочетаниях или без них.

Через 5 суток культивирования в различных вариантах обнаруживают следующие количества внеклеточной глюкозооксидазы (табл. 1).

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о необходимости указанных шести микроэлементов для синтеза глюкозооксидазы.

Резкое влияние микроэлементов сказывается на синтезе глюкозооксидазы и не влияет на рост гриба: количество выросшего мицелия практически одинаково во всех вариантах.

Пример 3
Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 выращивают по примеру 2, но в питательную среду, приготовленную на дистиллированной воде и содержащую следующие количества микроэлементов (в мг %): 0,5 ZnS0₄ • 7H₂O; 0,05 CuSO₄ • 5H₂O; 1,0 MnS0₄ • 7H₂O; 0,04 CoCl₂ • 6H₂O; 0,02 Na₂MoO₄ •2H₂O; 0,4 H₃ВО₃ - вносят различные количества нитрата калия. При увеличении концентрации нитрата калия выход внеклеточной глюкозооксидазы возрастает (табл. 2).

Источником сахарозы в средах служил пищевой сахарный песок.

Способ может быть использован и для других штаммов Penicillium funiculosum, имеющиеся у нас продуценты глюкозооксидазы вида Penicillium funiculosum проявляют следующую активность по предлагаемому способу:
Pen. funiculosum 481К-140 ед/мл. Pen. funiculosum 50К - 70 ед/мл. Pen. funiculosum 238K - 60 ед/мл, Pen. funiculosum 284К - 65 ед/мл, Pen. funiculosum 476K - 65 ед/мл.

Все штаммы, обладающие разной степенью активности, дали по предлагаемому способу глюкозооксидазы в несколько раз больше, чем вход глюкозооксидазы в прототипе (20 ед/мл). Максимальная активность наблюдается в пределах, предлагаемых по способу.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход глюкозооксиды и стандартизировать условия его осуществления.

Изобретение относится к области биотехнологии. Получаемая глюкозооксидаза используется в медицинской диагностике в пищевой промышленности. Штамм Penicillium funiculosum KM МГУ 433 обладает высокой глюкозооксидазной активностью. Внеклеточную глюкозооксидазу получают, выращивая штамм на среде, содержащей в качестве единственного источника азота нитрат калия. Среда также включает сахарозу, фосфаты, сульфат магния и источники микроэлементов. Предлагаемый штамм и способ обеспечивают выход внеклеточной глюкозооксидазы 140 - 150 ед/мл среды. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

1. Штамм Penicillium funiculosum КМ МГУ 433 - продукт глюкозооксидазы. 2. Способ получения внеклеточной глюкозооксидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма Penicillium funiculosum на питательной среде, содержащей сахарозу, нитрат калия, сульфат магния, источники микроэлементов - сульфат марганца и дистиллированную воду, отличающийся тем, что в среду дополнительно вводят гидрофосфат калия, из источников микроэлементов используют сульфат цинка и меди (II), хлорид кобальта, молибдат натрия и борную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мас.% (в пересчете на кристаллогидратные формы солей:
Сахароза - 8,0 - 12,0
Нитрат калия - 1,0 - 4,0
Дигидрофосфат калия - 0,15 - 0,4
Дигидрофосфат калия - 0,15 - 0,4
Сульфат магния - 0,05
Вода дистиллированная - Остальное
с добавлением источников микроэлементов, мг • мас.% (в пересчете на кристаллогидратные формы солей):
Сульфат цинка - 0,4 - 1,0
Сульфат меди (II) - 0,02 - 0,1
Сульфат марганца - 0,5 - 5,0
Хлорид кобальта - 0,04 - 0,1
Молибдат натрия - 0,02 - 0,1
Борная кислота - 0,4 - 1,0ч