Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

11282003

Изобретение относится к биохимии .. и может быть использовано в аналитической и клинической биохимии для определения активности глутатионпе- роксидазы (ГП).

Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа за счет использования оптимальных концентраций субстратов и остановки реакции осаждением белка при 0+ 1°С.

Способ осуществляется следующим образом.

К 0,5-5 мл венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА, 1 мг/мл), осаждают эритроциты, промывают осадок 0,15 М хлористым натрием, приготовленным на 0,005 М фосфатном буфере, рН 7,4, к эритроци- тарной массе добавляют раствор сапоЕ - оптическая плотность стандартной пробы (не содержащей гемолизата и гидроперекиси трет-бутила);

5 tp оптическая плотность нит- ропруссида в пробе, не содержащей супернатанта. Пример 1. Определение активности ГП проводят в пробе с конечным 10 объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 21 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 100 раз (по отношению к эритроцитарной массе). 5 Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации в пробе 8 мМ. Окисление GSH останавливают через 10 мин при встряхива- нина 0,1 мг/мл в соотношении 1:2, а 20 ,нии в ледяной бане, осаждая белок 1мл через 30 мин - 0,05 М фосфатный бу- 3%-ной НРО, приготовленной на насы- фер, рН 7,4, в соотношении к гемоли- щенном NaCl. зату 1:14, 1:4..К серии опытных проб ставят контК 0,15 мл 0,05 М фосфатного буфе- рольную и стандартную пробы. Гидропера рН 7,4 содержащего 0,002-0,03 М рекись трет-бутила в стандартной про- ЭДТА и 0,025-0,035 М восстановленный бе, а гемолизатв стандартной и конт- глутатион (GSH), добавляют 0,05 мл рольной пробах замещают соответствую- разведенного гемолизата, вьщерживают щим объемом дистиллированной воды. 3-5 мин при и начинают реакцию Пробы центрифугируют при 1 - добавлением 0,05 мл 0,02-0,04 М гид- 30 2 тыс.об./мин, после чего 0,1 мл супернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного NaCl, добавляют 0,5 мЛ 80 мМ нитропруссида Na и 0,05 мл 1,8 М . Экстинкцию измеряют спектророперекиси трет-бутила. После инкубации при 37 С в течение 4-10 мин осаждают белок на ледяной бане добавлением 0,5 мл 3%-ной HPOj, приготовленной на насыщенном растворе NaCl. Про-35 фото- или фотоколориметрически через бу центрифугируют, 0,05-0,1 мл супер- 5 с после добавления при натанта переносят в 3,9-3,95 мл насыщенного NaCl, через 3-60 мин добавляют 0,5 мл 0,08 М нитропруссида натрия и 0,5 мл 1,8 М и через 15 с 40 измеряют оптическую плотность при 540 нм.

540 нм. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе, не содержащей надосадка. Активность рассчитывают по формуле (1). Средняя активность ГП у 14 здоровых доноров 144,6t |t22,4 ммоль/мин/л эритромассы.

Активность ГП в 1 л эритроцитарной массы рассчитывают по формуле

IGSH

ЕК- Е

f

01.

ЕСТ- Еф

N,

50

исходная концентрация глутатиона;

время от начала до остановки реакции;

фактор разведения эритромассы;

оптическая плотность контрольной пробы (не содержащей гемолизат);

оптическая плотность опытной пробы;

оптическая плотность стандартной пробы (не содержащей гемолизата и гидроперекиси трет-бутила);

tp оптическая плотность нит- ропруссида в пробе, не содержащей супернатанта. Пример 1. Определение активности ГП проводят в пробе с конечным объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 21 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 100 раз (по отношению к эритроцитарной массе). Среду инкубируют 5 мин при 37 С и затем начинают реакцию добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации в пробе 8 мМ. Окисление GSH остафото- или фотоколориметрически через 5 с после добавления при

540 нм. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе, не содержащей надосадка. Активность рассчитывают по формуле (1). Средняя активность ГП у 14 здоровых доноров 144,6t |t22,4 ммоль/мин/л эритромассы.

5

0

Пример 2. Определение активности ГП проводят по примеру 1, однако среда инкубации содержит 14 мМ GSH и гемолизат с конечным разведением в 150 раз. Реакцию начинают добавлением гидроперекиси трет-бутила до концентрации 4 мМ, а останавливают через 5 мин. Осаждение и определение уровня остаточного глутатиона проводят по примеру 1. Активность рассчитьтают по формуле (.1). Активность ГП составляет 144,6t 4 ммоль/мин/л.

П |) и М е р 3. Определение активности ГП проводят в пробе с ко- нечньм объемом 0,5 мл, содержащей

31

50 мМ фосфатный буфер с рН 7,4, 18 мМ GSH, 2 мМ ЭДТА и гемолизат с конечным разведением фермента в пробе в 120 раз. Среду инкубируют 5 мин при и затем начинают реакцию добавлением гидроперекиси трет-бути- ла до концентрации 6 мМ в начальный момент реакции. Окисление GSH останавливают через 6 мин при встряхивании в ледяной бане, осаждая белок

1мл 3%-ной HPOj, приготовленной на насьщенном NaCl. Контрольную и стандартную пробы ставят по примеру 1.

Пробы центрифугируют при 1 2тыс.об./мин, после чего 0,1 мл су- пернатанта переносят в 3,9 мл насыщенного NaCl, добавляют 0,5 мл 80 мМ нитропруссида Na, а затем 0,5 мл

1,8 К Na.COj. Экстинкцию измеряют через 15 с спектрофото- или фотока- лориметрически. Фоновое поглощение нитропруссида Na определяют в пробе, не содержащей надосадка. АктивРедактор И.Николайчу к Заказ 7258/41

Составитель Н.Гуляева

Техред Л.Сердюкова Корректор А.Ильин

Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

.Производственно-полиграфическое- предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

820034

ность рассчитывают по формуле (1), Активность ГП составляет 144,6± 4 ммоль/мин/л.

Формула изобретения

Способ определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах

10 путем их гемолиза, инкубации гемоли- зата в присутствии восстановленного глутатиона и гидроперекиси трет-бу- тила с последующим спектрофотометри- рованием, отличающийся

J5 тем, .что, с целью повышения точности и чувствительности способа, используют глутатион в концентрации 14- 21мМ, гидроперекись трет-буткла в концентрации 4 - В мМ, реак20 цию останавливают осаяодением белка при температуре О ± , а к супер- натанту добавляют нитропруссид натрия в щелочной среде.

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - повьшение точности и чувствительности способа. К венозной крови добавляют этилендиаминтетрацетат (ЭДТА), осандают эритроциты. Промывают осадок. К эрит- роцитарной массе добавляют раствор сапонина и затем фосфатный буфер. В раствор с ЭДТА, фосфатным буфером и глутатионом добавляют разведенный гемолизат. Через 3-5 мин добавляют еще гидроперекись трет-бутила. После инкубации осаждают белок на ледяной бане. Пробу центрифугируют. Су- пернатант переносят в насыщенный раствор хлористого натрия и добавляют нитропруссид натрия и двууглекислый натрий. После этого измеряют оптическую плотность при 540 им и рассчитывают активность глутатионперок- сидазы. (Л