Способ определения активности амилазы Советский патент 1987 года по МПК G01N33/548 C12N9/32 

Изобретение относится к способам получпния хромот епных субстратов и преимущественно может быть исполь- :ювано в физико-химической биологии и медицине для определения активности амилазы,

Цель изобретения - увеличение чувствительности и сокращение времени анализа.

Способ осуществляют следующим.образом.

Картофельный крахмал подвергают набуханию в воде при 65-70 С, а обработку набухшего крахмала красителем проводит при концентрации щелочи 0,01 - 0,05 моль/л (рН 12) при 45 - 50°С в течение 1 ч. Окрашенные гранулы крахмала удаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще раз центрифугируют. Полученную густую массу пропитывают раствором, содержащим хлористый нат- рий и компоненты фосфатного буфера (рН 7,2), и высушивают лиофильно. В качестве красителя используют ди- хлортриазимовый активный ярко-голубой КХ. Предварительное набухание крахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при низком содержании электролитов позволяет при помощи отечественного ярко-голубого красителя КХ получить высокоактивный субстрат для определения активности амилазы.

Пример 1. 20 г картофельного крахмала суспендируют при комнатной температуре в 1 л дистиллированной воды. Набухание суспендированного крахмала проводят при постоянном перемешивании при 67°С в течение 20 ми Суспензию охлаждают до 48 С и прибавляют 5 г активного ярко-голубого красителя КХ, растворенного в 200 мл 0,02 М фосфатного буфера (рН 9). Через 15 мин к реакционной смеси прибавляют 5 мл 2 н. раствора NaOH.pH суспензии повьш1ается при этом до 12 (концентрация NaOH составляет при этом 0,01 М). Продолжительность реакции при постоянном перемешивании и при 48 составляет 1 ч. Гранулы крахмала вьщеляют из реакционной среды 1 5-минутным центрифугированием при 3000 об/мин, промывают водой и снова центрифугируют. Полученную густую массу гралул крахмала суспендируют в 200 мл раствора, .содержаще

5

0

5

0

5

0

5

0

5

го 5,32 г NaCl, Полученную суспензию высушивают лиофильно и получают 25 г синеп порошка. Полученный окрашенный субстрат используют для определения активности амилазы. В пробирках взвешивают по 40 мг окрашенного крахмала и прибавляют 2,3 мл дистиллированной воды. Суспензию термостатируют 5 мин при З7 с и прибавляют в каждую пробирку 0,2 мл раствора л -амилазы, содержащего О - 3,75 мг/л ферментного препарата фирмы Merck с активностью 277 международных единиц на 1 мг. Продолжительность реакции 15 мин при 37°С. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 мл 1,0 М раствора соляной кислоты. Реакционную смесь центрифугируют в течение,3 мин при 1600 об/мин и определяют оптическую 1шотность центрифугата на од- нолучевом спектрофотометре Specol 21 при 620 нм. Оптическая плотность по отношению к пробе t нулевым содержанием об -амилазы прямо пропорционально зависит от количества ферментного препарата в растворе, в котором проводится его определение (см.табл.1).

В скобках при количестве прибавляемого фермента также приведена -активность в международных единицах, которая получается в результате умножения количества прибавляемого ферментного препарата в 1 л раств о- ра на его первоначальную активность (см.табл.1).

Для определения активности оС -амилазы определенное количество окрашенного крахмального порошка суспендируют в воде, термостатируют и прибавляют пробу, содержащую Л-амилазу,инкубируют при постоянной температуре, отделяют непрореагировавший крахмал и фотометрически определяют оптическую плотность при 620 нм. По калибровочной кривой или по формуле,А &Dg,, где А - активность О, -амилазы в исследуемой жидкости, Е/л; CiDgjp - оптическая плотность пробы при 620 нм по отношению к пробе с нулевым содержанием о -амилазы; К - переходный коэффициент, который характеризует реакционную способность хромогенного субстрата и определяется при помощи стандарта с известной активностью, рассчитывают активность й-амилазы в исследуемом растворе.

Проводят сравнение реакционной способности субстрата, полученного по предлагаемому способу, с общеизвестными таблетками Phadebas фирмы Pharmacia для определения активности oi -амилазы в сыворотке крови человека.

Определение активности об -амилазы в сыворотке при помощи таблеток Phadebas проводят по методике фирмы. В пробирки помещают 4 мл дистиллированной воды и прибавляют одну таблетку, которая набухает в воде. Полученную суспензию термостатируют в течение 5 мин при 37°С, прибавляют 0,2 мл сыворотки крови человека, встряхивают и термостатируют 5 мин при . Реакцию останавливали прибавлением 1,0 мл 0,5 М раствора гидроокиси, натрия . Реакционную смесь центрифугируют 5 мин при 1600 об/мин и определяют оптическую плотность при 620 им. Активность об -амилазы в сыворотке в международных единицах на 1 л сыворотки (Е/л) находят по калибровочной кривой.

Определения с окрашенным крахмалом, полученным по предпагаемому способу, проводят по указанной методике Вместо об -амилазы прибавляют 0,2 мл сыворотки. Активность об - амилазы (А) в международных единицах на 1 л сыворотки рассчитывают по формуле:. А , где &Dg2o оптическая плотность пробы по отношению к пробе с нулевым содержанием об-амилазы при 620 нм,;

К - константа, характеризующая реакционную способность хромогенно- го субстрата с ot -амилазой, которая определяется по методике примера 2 при помощи стандарта о(,-амилазы с известной активностью. В данном случае К 954, Полученные результаты приведены в табл.2.

П р и м е р 2. Приводятся экспериментальные данные, показывакицие влия Щ1е солей и условий набухания крахмала на реакционную способность полученного хромогенного субстрата.

20 г картофельного крахмала суспендируют при комнатной температуре в 1 л дистиллированной воды. Набухание суспендированного крахмала проводят при постоянном перемешивании при . Температурный промежуток, в котором возможно проводить набухание, 65-70 с. Так как промежуток

.

85373

маленький.

fO

15

20

25

опыты проводятся при среднем значении 67 . При температуре Bbmje 70 крахмал становится слишком набухшим, сниженным, что затрудняет дальнейшую обработку крахмала красителем, а при температуре ниже 65 полного набухания не происходит и получают малоактивный препарат. После набухания суспензию охлаждамт до 50°С и разделяют на четыре порции по 250 мл.

Первую порцию окрашивают по примеру 1, прибавляя 1,25 г активного ярко-голубого красители КХ, растворенного в 50 МП 0,02 М фосфатного буфера. рН доводят до 12 прибавлением 1,25 мл 2 н.раствора NaOH (концентрация NaOH составляет при этом 0,05 М).

Вторую порцию окрашивают прибавлением 1,25 г этого же красителя, растворенного в 50 мл дистиллированной воды, а рН доводят до 12 прибавлением 2 H.NaOH, постоянно проверяя рН смеси рН-метром.

Третью порцию окрашивают прибавлением 1 ,25 г этого же красителя, растворенного в 40 мп дистиллированной воды; рН суспензии переводят в щелочную область прибавлением 10 мл 1,5 М раствора .

В четвертую порцию прибавляют 1,25 г этого же красителя, растворенного в 40 МП дистиллированной во- 35 ды, и 28 г безводного NajSO. рН суспензии переводят в щелочную область прибавлением 10 мл 1,5 М-раст- вора Na,P04.

Пятый и шестой образцы получают набуханием 10 г картофельного крахмала в 500 МП дистиллированной воды при постоянном перемешивании при 50 С в течение 1 ч. Суспензию разделяют ца две порции по 250 мл.

Пятый образец подвергают окрашиванию по методике первой порции, а шестой - по методике четвертой порции.

50 Во всех случаях окрашивание, проводят при постоянном перемешивании при в течение 1 ч. Гранулы крахмала выделяют из реакционной среды центрифугированием, npoMsiBa55 ют водой и снова центрифугируют.Все образцы, полученные в виде густой массы, суспендируют в 50 мп раство30

40

45

ра, ; содержащего 1,33 г X 12Н„0 и 1,65 г NaCl.

UHjO и

доводят до 7,2 добавлением 2 М раствора НС1. Полученные суспензии высушивают лиофильно в лиофилизаторе.

Качество г олученного окрашенного крахмала как субстрата для определения ферментативной активности od -амилазы характеризует скорость его гидролиза под действием фермента.Опре- деление ферментативной активности проводят по примеру 1, прибавляя в пробирки по 40 мкг препарата оС -амилазы. Полученные результаты приведены в табл.3, где Dg2o прямо пропорциональна скорости ферментативного гидролиза.

Из приведенного примера видно,что повьшение концентрации солей в растворе окрашивания и особенно понижение температуры набухания крахмала

to

известного способа, в котором процесс проводят без предварительного набухания и в присутствии сульфата натрия (до 10%-й концентрации) позволяет сделать вывод, что при использовании предлагаемого способа увеличивается чувствительность и сокращается время анализа при определении активности амилазы.

Формула изобретения

- Способ определения активности амилазы, предусматривающий получение 15 хромогенного субстрата путем обработки крахмала активным красителем в щелочной среде, промывание и высушивание окрашенного крахмала, смепшва- ние его с раствором амилазы и анализ

приводят к понижению реакционной спо-20 полученного раствора, отличаюсобности синтезированного субстрата. Таким образов, использование красителя с двумя активными группами по сравнению с известным способом, в котором используется краситель с одной активной группой, и проведение окрашивания набухшего при бЗ-ТО С крахмала при концентрации щелочи 0,01-0,05 моль/л при отсутствии посторонних электролитов в отличай от

щ и и с я тем, что, с цепью увеличения чувствительности и сокращения времени анализа, крахмал перед обработкой активным красителем подверга25 ют набуханию в воде при бЗ-ТО С, причем в качестве красителя использу- ют ярко-голубой ЮС, а обработку крахмала красителем ведут при температуре от 45 до и концентрации ще30 лочи от 0,01 до 0,05 моль/л.

Таблица

Оптическая плотность 620 нм

при

0,22

известного способа, в котором процесс проводят без предварительного набухания и в присутствии сульфата натрия (до 10%-й концентрации) позволяет сделать вывод, что при использовании предлагаемого способа увеличивается чувствительность и сокращается время анализа при определении активности амилазы.

Формула изобретения

- Способ определения активности амилазы, предусматривающий получение хромогенного субстрата путем обработки крахмала активным красителем в щелочной среде, промывание и высушивание окрашенного крахмала, смепшва- ние его с раствором амилазы и анализ

20 полученного раствора, отличающ и и с я тем, что, с цепью увеличения чувствительности и сокращения времени анализа, крахмал перед обработкой активным красителем подверга25 ют набуханию в воде при бЗ-ТО С, причем в качестве красителя использу- ют ярко-голубой ЮС, а обработку крахмала красителем ведут при температуре от 45 до и концентрации ще30 лочи от 0,01 до 0,05 моль/л.

Таблица

0,43

0,65

0,89 1,08

Таблица 2/.

Редактор А.Сабо

Составитель А.Синицьш Техред И.Попович

Заказ 7638/46 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по цепам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Т а б л и ц а 3

Корректор М.Демчик

Изобретение относится к физико- химической биологии и медицине и может быть использовано для получения хромогенных субстратов при определении активности амилазы. Целью изоб- .ретения является увеличение чувствительности и сокращение времени анализа. Картофельный крахмал подвергают , набуханию в воде при 65-70°С с последующей обработкой красителем при концентрации щелочи 0,01-0,05 моль/л (рН 12) при температуре 45 - 50°С в течение 1 ч. Окрашенные гранулы крахмгша удаляют из реакционной смеси центрифугированием, промывают водой и еще раз центрифугируют. Полученную густую массу пропитывают раствором, содержащим хлористый натрий и компоненты фосфатного буфера (рН 7,2) и высушивают лио(|ильно. В качестве красителя используют дихлор- триазимовый активный ярко-голубой КХ. Предварительное набухание крахмала в узком интервале температур и проведение обработки набухшего крахмала при ннзком содержании электролитов позволяет при помощи отечественного ярко-голубого красителя КХ получить высокоактивный субстрат для определения активности амилазы. 3 табл. с (Л С ю 00 ел со