Способ получения окрашенного субстрата для определения целлюлазной активности Советский патент 1983 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к энзимологии, микробиологии и микробиологичес кой промыиигенности и может быть использовано для определения целлюлазной активности в ферментных препаратахи в биологических средах. Известен способ получения окрашен ного субстрата для определения актив ности целлк лаз, включакяций активирование карбоксиметилцеллюлозы карбоди имидом и связ{-шание ее с хромофорными веществами через нитрофенильные группы 1. Недостатками способа являются необходимость активации карбоксиметилцеллюлозы к арбодиимид ии перед добав. лением хромофорных веществ, а также наблюдаемое снижение активности целлюлазы при взаимодействии с нитрофенильными группами. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения окрашенного субстрата для определения целлюлазной активности путем окрашивания карбоксиметилцеллюлозы активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и оса)едением целевого продукта этанолом, причем карбоксиметилделлюлозу предварительно.обрабатьшают раствором целлюлаэы.для частичной депо-. лимеризации, отделение несвязанного красителя проводят с помощью многократного переосаждения этанолом, содержащим 0,02 М КС1, в качестве красителей используют ремазол ярко-чер,ный В или ремазол ярко-синий R при соотношении краситель-карбоксиметилцеллюлоза 1:1 по весу. Процесс окрашивания обычно осуществляют при 60°С 2. Однако субстрат, получаемый таким способом, обладает узким прямолинейным интервалом зависимости оптической плотности от глубины превращения. Это сужает пределы определения ферментативной активности целлкхлазHbLK комплексов, что является недостатком качества получаемого продукта. Кроме того, карбоксиметилцеллюлоза, окрашенная ремазолом ярко-черным .В, образует в воде желеобразные суспензии, что приводит к искажению результатов определения активности. Еще один недостаток известного способа в том, что он трудоемок. Это связано с необходимостью ча;стичной деполяризации исходной карбоксиметилцеллюлозы с помощью целлюлазного комплекса с целью улучшения растворимости субстрата. Кроме того, .многократное осаждение окрашенного продукта большим количеством этанола удаления не связанного ков лентно красителя снижает выход субстрата, Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта, повышение его выхода и упрощение процесса. Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения окрашенного субстрата для определения целлюлазной активности, предусматривающим окрашивание карбоксиметилцеллюлозы активным красителем с последутщим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, причем окрашивание осуществляют красителем активным яркооранжевым ЖТ, взятым в количестве 20-200% от массы карбоксиметилцеллюлозы, а отделение несвязанного кра- . сителя осуществляют с помощью диафильтрации. Окрашивание обычно осуществляют пр 30-60°С. Способ осуществляется сггедующим образом. Связывание красителя с карбоксиметилцеллюлозой проводят в течение 1-2 ч при ЗО-бО С.Диафильтрацию про- водят до получения оптической плотности диафильтрата при длине волны 490 нм не более 0,8 (для удаления ковалентно несвязанного красителя и солей из раствора окрашенного субстрата) с последуьощим осаждением полученного, продукта этанолом. При , диафильтрации раствор окрашенного субстрата концентрируют, затем разбавляют концентрат дистиллированной водой до первоначального объема и опять подвергают диафильтрации. Таким образом, проводят несколько циклов диафильтрации окрашенного субстрата, пока не достигнут оптической . плотности .диаф-ильтрата при длине . волны 490 нм не более 0,8. Установлено, что процесс диафильтрации окрашенного раствора карбоксиметилцеллюлозы подчиняется экспоненциальной функции. Для расчета необходимого количества воды для диализа пользуются следующей формулой; V -2,84V enC/C, , где V - необходимый объем воды для диализа окрашенного раствора карбоксиметилцеллюлозы; VQ - исходный объем окрашенного раствора карбоксиметилцеллюлозы после первоначального концентрирования; С - оптическё-я плотность Фильтрата после диафильтрации; Сд - оптическая плотность () исходного раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлозы Пользуясь формулой (1), заранее определяют необходимый для диализа объем воды (при достижении в конечном диафильтрате .D 490 не более 0,8). Пример. Юг карбоксиметил целлюлозы растворяют в 1000 мл воды, перемешивая, приливают 1000 мл О,2%-ного раствора красителя активного ярко-оранжевого ЖТ. В течение 60 мин небольшими порциями добавляют 20 г Nci2S% после чего приливают 100 мл 10%-ного раствора и перемешивают еще 60 мим. Все операции проводят при 39°С. Полученный раствор охлаждают до комнатной темпераг туры и концентрируют диафильтрацией до конечного объема 0,5 л. Далее в диафильтрате определяют 0.90 Согласно формуле (1), объем воды для дигшиза составляет ,84-0,5 1п||- 5,7 л После завершения процесса диафильтрации полученный кбнцентрат (500 мл) осаждают 1000 мл этанола в присутствии 0,01 М КС1,- Выпавший оса док окрашенной карбоксиметилцеллюло.эа отделяют центрифугированием, промывают этанолом, эфиром и высушивают в вакуум-эксикаторе. Получают ..7/5 г субстрата, имеющего врад оранженого порошка, хорошо растворимого в воде. П р и м е р 2. 20 г карбоксимети целлюлозы .растворяют в 1000 мл воды при б Ос, приливают 1000 мл 4%-ного раствора активного ярко-оранжевого ЖТ, добавляют 40 r-l cfjSO, 200 мл 10%-ного раствора перемешивают реакционную смесь 60 мин при , Далее выделение субстрата проводят аналогично примеру 1. Получают 18,0 г субстрата в виде ярко-оранжевого порошка. Определения целлюлазной активности.. В две пробирки наливают по 1,0 мл 1%-ного раствора субстрата (полученного по примеру 2) в 0,1 М ацетатном буфере, рН 5,0, В одну пробирку.приливают .0 ,2 мл целлобронина П Ох с концентрацией 2,5 мг/мл, в другую 0,2 мл буфера (контроль) и инкубируют при в течение 10 мин, после чего в каждую пробирку добавляют по 5 мл осадителя, содержащего 80%-ный монометиловый эфир этиленгликоля, ацетатный буфер (0,3 М/ рН 5) и 0,4% ацетата цинка. Реакционную смесь (взбалтывают, вьщерживают 0,5 мин и центрифугируют 5 мин, после чего определяю оптическую плотность супернатанта при длине волны 490 им против контрольной пробы. Оптическая плотность 0,4X0. Сравнительная оценка растворимости окрашенного субстрата, изготовленного по предлагаемому и известному способам дана в таблице.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ OKPAUEH0ОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮ ЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ путем окрашивания карбоксиметилцеллюлозы активным красителем с последующим отделением несвязанного красителя и осаждением целевого продукта этанолом, о л и чающийс я тем, что, с целью улучшения качества целевого продукта, повышения его выхода и упрощения процесса, окрашивание осуществляют красителем активным ярко-оранжевым ЖТ, взятым в количестве 20-200% от массы карбоксиметилцеллюлозы, а отделение несвязанного красителя осуществляют с помощью диафильтрации. 2. Способ по п. 1, отл.ичающ и и с я тем, что окрашивание осу(Л ществляется при 30-6О с. СП с: О ел ел

Растворимость определяют след5аоцим образом: 0,5 г субстрата заливают 50 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,0), смесь перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре и определяют время,, необходимое для полного растворения субстрата. . .Из таблицы видно, что растворимость предлагаемого и известного суб стратов лежит в интервале 15-20 мин, из чего следует, что упрощение техно логии по предлагаемому способу не ухудшает растворимости субстрата. Вы ход субстрата по предлагаемому спосо бу превышает его выход по известному способу на 20-35%. На чертеже показана зависимость оптической плотностр от глубины -превращения (времени инкубации) предлагаемого субстрата. Эту зависимость определяют по описанной методике, используя целдюлазРапидазаные комплексы и целх:р-г бронин ГЮх по 0,04 ед, в каждой пробе (за единицу принимают активность такого количества фермента, которое расщепляет 1 мк моль гликозидных связей за 1, мин,) . Как видно из чертежа прямолинейный интервал зависимости оптической плотности от глубины превращения субстрата О - 0,9 обеспечивает широкие преде.пы определения активности целлюлаз, что, в свою очередь, повыгшает точность определения. Таким образом, качество получаемого субстрата эначительно лучше, чем известного,

Предлагаемлй способ получения окрашенного субстрата для определения целлюпазной активности упрощает технологию изготовления субстрата тем, что исключается предварительная обработка карбоксиметилцеллюлозы целлюлазным комплексом. При этом растворимость окрашенного субстрата, изготовленного по предлагаемому и известному способам, сходная. .

Диафильтрация.через полупроницаемые мембраны раствора окрашенной карбоксиметилцеллюлозы позволяет уда(пить ковалентно не связанные краси гель и соли и обеспечивает выход субстрата 75-90% (по известному способу выход продукта составляет 50-60%) , Предлагаемый способ.диафильтрации позволяет исключить многократное переосаждение субстрата большими объемами этанола, тем самым упрощается технологический процесс noriro- товки субстрата и увеличивается безопасность процесса.

Предлагаемым способом получают субстраты, которые обеспечивают широкие пределы определения ферментативной активности комплексов, поскольку обладают прямолинейным интервалом зависимости оптической плотности от глубины превращения субстрата (О -0,9), тогда как такой интервал для субстрата, изготавливаемого по известному способу составляет О - 0,