Способ получения сорбента для афинной хроматографии Советский патент 1982 года по МПК C08B37/12 G01N31/08 

натной те шературе, отмывают дистилированной водой, затем осуществляют взаимодействие полученного продук та с 2 вес.ч. вещества формулы (I) в присутствии 10 вес.ч. хлорида натрия и 2 нес.ч. карбоната натрия, тща тельно перемешивают и подвергают обработке при 10 ч. Вещество указанной формулы называется цибакрон синим красителем. Сорбент предназначен для аффинной хроматографии альфа-фетопрогеина итрофобластспецифического бета-глобул на, помимо этого сорбент может быть использован для аффинной хроматографии тех белков, которые аффинны к голубой сефарозе Полученный .продукт представляет собой мелкогранулированный гель сефа розы ярко-голубого цвета, обладающий хорошими механическими и фильтрующиО УНг . MH $020 где R, - Н, S02.0Na; R - SQ2.0Na, Н; R - сефароза, выбранная из группы комерческих препаратов, например сефарозы 2В, сефароза CL 2В, сефароза 4В, . сефароза CL 4в, сефароза 6В, сефароза CL 6В. . В результате синтеза сначала получается дихлортриазиновое производное сефарозы, в котором оба атома хлора весьма активны в щелочной среде, поэтому реакцию проводят в избытке трихлортриазина в течение короткого промежутка времени - 10-15 мин (избыток трихлортриазина необходим, чтобы связать все активные гидроксильные группировки сефарозы, а короткий промежуток времени, чтобы не успеть отгидролизовать лишние атомы хлора. Конъюгация дихлортриазинового производного сефарозы с гептаметилендиамкном проводится в присутствии би1 арбоната натрия, что обеспечивает ||еобходимую щелочную буферную емкость среды. Избыток гептаметилендиамина и длительность процедуры коньюгации (2-10 4j обеспечивают полноту связывания и отгидролизовывание третьего (последнего) атома хлора. Полученное производное сефарозы не содержит активных {стерически доступных) гидроксильных групп, они все блокированы триазином и содержат только активные ми свойствами, поэтому его можно использовать в колоночной хроматографии. Он выдерживает максимальное давление без нарушения фильтрующих способностей от 50 см вод. ст. для сорбента, синтезированного на основе сефарозы 2В, до 150 см вод. ст. для сорбента, синтезированного на базе сефарозы CL 6В. Количество связанного в сорбенте красителя, определяющееся путем гидролиза 1 мл сорбента в 0,1 М НС1 в течение 10 мин при с последующей спектрофотометрией при 610 нм, колеблется от 0,85 мг цибакрона синего на 1 мл сорбента, синтезированного на базе сефарозы CL 2В, до 1,52 мг красителя на 1 мл сорбента, синтезированного на основе сефарозы 6В. Полученный сорбент может быть изображен в виде формулы; V (CH2)7-NH-rnY о-в. аминогруппы, которые могу-г участвовать в дальнейших реакциях. На этом этапе синтеза полученное нами производное сефарозы с введенными в нее аминогруппами реагирует в присутствии карбоната натрия с цибакрон синим красителем. Цибакрон .синий краситель является производным трихлортриазина , в котором два атома хлора уже замещены, а один атом хлора остается реакционноспособным и момсет (реагировать со свободными (не аротическими аминогруппами. Так как это последний из атомов хлора молекулы трихлортриазина, он менее реакционноспособен и для реакции необходим-рН около 1Q-11 и повышенная температура ( и выше). В данном случае реакция может идти только по свободной аминогруппе производного сефарозы и хлору цибакрон синего красителя, в результате чего получается описанный сорбент. Концентрация раствора трихлортриазина не должна превышать 3%, потому Ч.ТО трихлортриазин плохо растворим в водных растворах ацетона и его избыток выпадет в осадок, а при добавлении раствора трихлортриазина в безводном ацетоне к суспензии сефарозы ацетон обводняется. Концентрация гептаметилендиамина более 3% нежелательна из-за слишком большого повышения . рН среда (за 11 / и наступающего вследствие этого щелочного гидролиза се роэы и ухудшения ее фильтрующих и механических свойств. Уменьшение концентрации трихлор триазина { меньше 1% ) может привест к неполной блокаде всех реакционно способных гидроксильных групп сефа розы и тем самь1м последующее присоединение цибакрон синего красите ля может произойти по этим группам Уменьшение концентрации гептаметилендиамина приводит к существенному понижению емкости получаемого со бента (примерно в 4-5 раз), в то время как концентрация бикарбоната натрия может быть понижена до 0,5% а увеличена быть не может из-за плохой его растворимости в данной среде. Хлорид натрия добавляют для того чтобы избежать расплавления сефаро зы поэтому снижение концентрации нецелесообразно из-за ухудшения фил трующих свойств сорбента, а увеличение затруднительно, так как при Данных условиях он не растворяется полностью. Повышение концентрации карбоната натрия при температуре 55°С приводит к ухудшению фильтрующ свойств сорбента вследствие частичн го щелочного гидролиза сефарозы и ее расплавления в связи с этим, уменьшение же концентрации карбоната натрия в смеси (меньше одной частиj приводит к уменьшению емкости сорбента примерно в 2 раза. Так как реакционная способность аминогрупп довольно высока, то тепловую обработку вполне можно приводить при , но в течение 10 ч или при 55С в течение 5 ч. Проведение коньюгации по наименьшим значениям признаков способа (концентрация, время, температура}, которые приведены выше, дает возможность получит сорбент, емкость которого в 4-5 раз меньше, чем у получающихся в приведенных примерах. Пример 1. Сорбент общей фор мулы СП) г где R - сефароза 4В, представляющий собой мелкогранулиро ванный гель сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий без нарушения фильтрующих способностей 120 см вод. ст. и содержаший на 1 глл геля 1,41 мг цибакрон синего красителя, приготовляется следующим образом. К 100 г геля сефарозы 4В добавляют 100 мл ацетона, содержащего 2 г .трихлортриазина, смесь ставят на магнитную мешалку и перемешивают, добавляя по каплям 1 М раствор едкого натра, чтобы поддерживать рН 8,0. Такое титрование продолжается 5 мин, пока рН раствора не установи ся на 8,0 и не перестанет снижаться далее выдерживают.при перемешивании еще 5 мин и сефарозу отмывают последовательно 2 л 50%-ного водного ацетона и 2 л дистиллированной воды на бюхнеровской воронке. После отмывания сефарозу переносят в химический стакан, добавляют раствор в количестве 50 мл, в котором предварительно растворяют по 3 г бикарбоната натрия и гептаметилендиамина, и ставят на магнитную мешалку на 2 ч, после чего полученное производное сефарозы отмывают на бюхнеровской воронке 2 л дистиллированной воды. Затем гель сефарозы переносят в химический стакан, добавляют к нему 2 г цибакрон синего красителя в порошке, 10 г хлористого натрия, тщательно перемешивают, добавляют. 2 г карбоната натрия, еще раз тщательно перемешивают и ставят в суховоздушный термостат при 55°С на 10 ч. Полученный сорбент тщательно отмывают на бюхнеровской воронке дистиллированной водои до полного обесцвечивания промывной воды, в экспериментах по аффинной хроматограции данный сорбент помимо альбумина и некоторых других сывороточных белков при пропускании через него сыворотки плода человека обратимо связывает альфа-фотопротеин, а при пропускании через него сыворотки крови беременной женщины обратимо связывает .трофобластспецифический бета-глобулин. Пр име р 2. Сорбент общей формулы (II), где R - сефароза 2В, представляющий собой мелкогранулированный гель сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий без нарушения фильтрующих способностей давление в 50 см вод. ст. и содержащий на 1 мл геля 0,89 мг цибакрона синего, приготавляетйя следующим образом. К 100 г геля сефарозы 2В добавляют 100 мл ацетона, содержащего 1 т трихлортриазина, далее продолжают по примеру 1, а конъюгацию с гептаметилендиамином проводят в течение 10 ч. Полученный сорбент в экспериментах по аффиной хроматографии связывает альфа-фегопротеин.и трофобластспе-. цифический бета-глобулин, как и сорбент, описанный в примере 1. Примерз. Сорбент общей формулы (II), где R - сефароза 6В, представляющий собой мелкогранулированный гель сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий без нарушения .фильтрующих способностей давление 130 см вод. ст. и содержащий на 1 мл геля 1,52 мг цибакрон синего красителя, приготовляют следующим образом. К 100 г геля сефарозы бВ добавляют 100 мл ацетона, содержащего растворенным в нем 3 г трихлортриазина, далее перемешивают 15 мин, поддерживая рН 8,5 добавлением 1 М едкого натра. и продолжают процедуру по примеру 1 Полученный сорбент по своей биоспеци фичности аналогичен сорбенту, описан ному в примере 1. П р и м е р 4. Сорбент общей формулы, (II), где R , - сефароза CL 2В, представляет собой мелкогранулирован ный гель сефарозы, окрашенный в ярко-голубой цвет, .выдерживающий без нарушения фильтрующих способностей давление в 70 см вод. ст. и содержащий на 1 мл геля 0,85 мг цибакрона синего. Этот сорбент приготовляют следующим образом. К 100 г геля сефарозы CL 2В добавляют те же вещества, в той же последовательности ив тех же условиях/как в примере 2. Полученный сорбент обладает аффинность аналогичной для. сорбента, полученног в примере 1. Примерз. Сорбент общей -формулы (II), где R- - сефароза CL бВ, представляющий собой мелкогранулированный гель сефарозы, окрашенный в ярко-голубой цвет, вьвдерживающий без нарушения Фильтрукндих способностей давление в 150 см вод. ст. и содержащий на 1мл геля 1,43 мг цибакрон синего красителя получают следукядам .способом. К 100 г сефарозы CL 6В добавляют равное количество 3%-ного ра створа трихлортриазина в безводном ацетоне, перемешивают в течение 15 мин, поддерживая рН 8,5 добавлением по каплям 1 М раствора едкого натра, отмывают водным ацетоном и водой и далее добавляют 50 г-ш водного раствора, содержащего по 2% гептаметилендиамина и бикарбоната натрия, далее процедуру осуществляют по примеру 1. Полученный сорбент в экспериментах по аффинной хроматографии ведет себя аналогично сорбен,ту, описанному и полученному в примере 1. Свойства сорбентов, полученных в конкретных примерах следующие. Пример 1 - механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих свойств 120 см вод. ст. (давление), емкость - способен связать 10 мг альбумина , пример 2 - механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих свойств давление в 50 см врд. ст., емкость - 8 мг альбумина на 1 мл геля, пример 3 - механические Свойства: выдерживает без нарушеЧИЯ фильтрующих способностей давлени в 130 см вод. ст., емкость - 12 мг альбумина; пример 4 - механические свойства; способен выдержать без изменения фильтрующих свойств давление в 70 см вод. ст., емкость - 7 мг альбумина; пример 5 - Ме.ханические свойства: выдерживает без нарушения Фильтрующих способностей давление & 150 см вод. ст., емкость - 10 мг альбумина на 1 мл сорбента. Фильтруюие свойства сравниваются путем определения скорости протекания 0,1 М раствора хлористого натрия через колонки, наполненные сорбентами, как путем свободного протекания, так и под действием перистальтического насоса. В последнем случае отсутствие нарушения фильтрующих свойств констатируется, если скорость протекания (количество миллилитров за... единицу времени) через колонку с сорбентом совпадает с проспектными дан- . ными, характеристическими для данного типа перистальтического на- coca. Емкость предложенного сорбента для альфа-фетопротеина 2-5 мг на миллилитр, для трофобластспецифического бета-глобулина 4-6 мг на миллилитр. Полученный таким образом сорбент обладает фильтрационными свойствами такими же, как импортный фирменный сорбент голубая сефароза, не уступая ей по стойкости и стабильности. Но самое главное, что этот сорбент имеет новые биоспецифические качества. Он способен адсорбировать в экспериментах по аффинной хроматографии некоторые новые белки, которые не способен адсорбировать фирменный сорбент голубая сефароза. Этими белками являются альфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин, которые известны как раковоэмбриональные белки и используются в ранней диагностике рака, а именно для приготовления иммунодиагностикумов. Сравнивая емкость полученных нами сорбентов с фирменной голубой сефарозой по адсорбции сывороточного аль- бумина человека, получили следующие результаты. На 1 мл сорбента обратимо сорбировалось голубая сефароза 10 мг.альбумина, сорбент из примера 110 мг альбумина, сорбент из примера 2 - 8 МГ альбумина, сорбент из примера 3-12 мг альбумина, сорбент из примера 4 - 7 мг альбумина и сор бент из примера 5-10 мг альбумина. Таким образом, полученный нами сорбент, обладая хорошими механическими, фильтрующими свойствами и емкостью, не уступающими фирменной голубой сефарозе, имеет по сравнению с ней преимущества по биоспецифичности и может быть применен в препаративной химии белка для аффинной хроматографии таких раковоэмбриональных белков, как а.льфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин.

Формула изобретения

Способ получения сорбента для афинной хроматографии, отличающийся тем, что с целью увеличения емкости сорбента по отношению к альфа-фотопротеину и трофобластспецифическому бета-глобулину, к 100 вес.ч. сефарозы добавляют 80100 вес.ч. р аствора трихлортриаэина в безводном ацетоне, содержащего 1- 0 3 вес.% трихлортриазина, перемешивают |10-15 мин при рН 8,0-8,5, отмывают последовательно водньам раствором ацетона и дистиллированной водой, добавляют 50 вес.ч. водного раствора, 15 содержащего по 2-3 вес.% гептаметиленриамина и бакарбоната натрия, перемешивают 2.-10 ч при комнатной температуре, отмывают дистиллированной водой, затем осуществляют взаимодействие 20 полученного продукта с 2 вес.ч. ьёщёства формулы (I)

где R - Н или или Н,

в присутствии10 вес.ч. хлорида натрия и 2 пес.ч. карбоната натрия, тщательно перемешивают в подвергают обработке при 10 час.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

. 1. Bohme Н.I. и др. Affinity chromatography of phpsphofVuctokinase Using Cibacron bio F3G-A -Joornal of chn-omatogvaphy, т. 69, опублик. 1972, q. 209-214 (прототип).