Способ получения глицеролкиназы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/12 

4

00 со со

00

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения ферментов, и Ножет быть использовано в микробиологической, химической и , медицинской промьшшенности.

Глицеролкиназа (К.Ф.2.7.30) может применяться в качестве основного компонента реакционной смеси, используемой для определения глицерина при Ю его производстве в х имт1еской промьш- ленности, при измерении потребления глицерина как субстрата в микробиологической промышленности. В медицине Глицеролкиназа используется для опре-15 деления содержания триглицеридов в крови.

Цель изобретения - упрощение процесса очистки и повьшение выхода фермента глицеролкиназы,,20

На фиг. 1 показана аффинная хроматография глицеролкиназы на иммобилизованном красителе активном ярко-голубом КХ (1 - концентрация белка, 2 - удельная активность глицеролкиназы); 25 на фиг. 2 - влияние рН на стабильность глицеролкиназы; на фиг. 3 - влияние рН на активность глицеролкиназы.

Способ заключается в том, что

после тепловой обработки проводят

аффинную хроматографию на сефарозе 4Б с иммобилизованным; триазиновым

красителем активным ярко-голубым КХ (ГОСТ 20447-75). Краситель прочно . 35

связывается с агарозной матрицей - с сефарозой, что обеспечивает возможность длительного использования

сорбента лиганда.

Дпя выделения глицеролкиназы го- 40 могенат, полученный после дезинтеграции дрожжевой биомассы (вьфащенной в питательной среде с глицерином) , подвергают тепловой обработке (10 мин при 60°С), отделяют коа- 45 гулированный белок центрифугированием, хроматографируют на колонке с сефарозой 4Б с пришитым красителем активным ярко-голубым KIC. Фракции, содержащие активность глицеролкиназы, Q наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюируют с нее 0,5 М раствором NaCl. Выход фермента составляет 68- 72% от содержания его в бесклеточном экстракте. .55

В предлагаемом способе фермент непрочно связывается с красителем и после нанесения на сорбент вымывается исходным буфером (Ьиг.О. Такой

подход дает возможность еще больше упростить процедуру очистки и получить фермент без добавок элюирующих веществ, что позволяет наносить активные фракции на ионообменник для дальнейшей очистки без дополнительной обработки.

Пример 1. Дрожжи Candida va- lida Y-622 вьфащивают в среде Ридер с глицерином (1%) в колбах на качалке. После культивирования. (16 ч) клетки собирают центрифугированием (4000 g, 10 мин), промывают 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0) и снова центрифугируют. Промытые клетки суспендируют в 0,05 М фосфатном буфере (рН 6,0), содержащем 10 мМ MgCl,, 10 мМ глицерина, 1 мМ ЭДТА (буфер А) в соотношении 10 мп буфера на 1 г дрожжей. Клетки разрушают путем про- давливания на прессе из замороженного состояния. Неразрушенные клетки и клеточные стенки удаляют центрифугированием. Бесклеточный экстракт прогревают 10 мин при на водяной бане, коагулированный белок отделяют центрифугированием (4000 g, 20 мин). Супернатант (5 мл) наносят на колонку (2,5 20 см), заполненную сефарозой 4Б со связанным красителем активным ярко-голубым КХ и уравновешенную буфером А.

Краситель связывается с сефарозой следующим образом. К 150 мл сефарозы добавляют 2,5 в 50 мл дистиллированной воды и 50 мл 2%-ного раствора красителя, затем смесь инкубируют 40 ч при 45 С с перемешиванием. После инкубации гель переносят на воронку Бюхн ера и отмывают сначала дистиллированной водой, затем 0,1 н, НС1 (0,5 л), снова водой 0,1 н. NaOH (0,5 л) и водой до нейтрального рН (6). Полученным сорбентом заполняют колонку и уравновешивают буфером А.

Элюцию фермента с красителем проводят исходным буфером и собирают фракции по 2 мл (фиг.1). Фракции, содержащие активность глицеролкиназы, объединяют и наносят на колонку (1, см) с ДЭАЭ-сефарозой, уравновешенную буфером А. Фермент элюируют тем же буфером, содержащим 0,5 М NaCl. Скорость элюции в обоих случаях 44 мл в час. Процедура очистки суммирована в таблице. Выход фермента составляет 72% от содержания в

грубом экстракте, удельная активность 65 Е/мг белка. При электрофорезе в ПААГ препарат глицеролкиназы дает одну минорную полосу. Фермент очищен в 325 раз. Активность глицеролкиназы определяют в сопряженной реакции с глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой (7) . К объединенным фракциям, содержащим активность глицеролкиназы, добавляют для стабилизации фермента (№4)2 50 до концентрации 2 М и этиленгликоль (10% по объему). В таком виде суспензия фермента готова к употреблению и стабильна в течение года.

Глицеролкиназа из Candida valida стабильна при рН 5,0-6,0 (фиг.2). Оптимальное значение рН для реакции фосфорилирования глицерина составляет 9,8 (фиг. 3).,

В таблице дана процедура очистки глицеролкиназы из Candida valida.

Пример2. В качестве источника глицеролкиназы используют дрожжи 25 Candida lipolutica 695 (ВКМ У-2378). Культивирование дрожжей и вьщеление глицеролкиназы проводят по примеру 1. Выход фермента составляет 68%, удельная активность 35 Е/мг белка, степень очистки - 116 раз.

ПримерЗ. В качестве источника выделения глицеролкиназы используют дрожжи Saccharomyces-cerevinae 354. Культивирование дрожжей и вьщеление

30

35

фермента проводят аналогично предьщу щим примерам. Выход фермента состав

10

15

20

25

.

30

35

ляет 70%; удельная активность 50 Е/мг белка; степень очистки - 220 раз.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить процесс получения глицеролкиназы и повысить выход продукта в 1,9-2 раза по сравнению с известным способом за счет сокращения числа стадий очистки и применения метода аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным красителем активным ярко-голубым КХ.

Способ позволяет значительно сократить продолжительность процесса очистки фермента.

Формула изобретения

Способ получения глицеролкиназы, предусматривающий культивирование дрожжей на питательной среде, содержащей минеральные соли и глицерин, получение бесклеточного экстракта с последующим выд елением из него фермента с использованием тепловой обработки и хроматографии на слабооснов- ном анионите с полисахаридной основой в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,0 и элюцией 0,5 М раствором хлористого натрия в том же буфере, отличающийся тем; что, с целью упрощения процесса и повышения выхода продукта, после тепловой обработки провод я т аффинную хроматографию на сефарозе 4В с иммобилизованным триазиновым красителем активным ярко-голубым КХ.

Изобретение относится к области биотехнологии. Цель изобретения - упрощение процесса очистки и повьшение выхода целевого продукта. Способ предусматривает использование аффинной хроматографии на агарозном сорбенте с иммобилизованном красителем активным ярко-голубым КХ для вьщеления и очистки фермента. Гомогенат, полученный после дезинтеграции дрожжевой биомассы, подвергают тепловой обработке (10 мин при 60 с), отделяют коагулированный белок центрифугированием, хроматографируют на колонке с сефарозой 4Б с пришитым красителем активным ярко-голубым КХ. Фракции, содержащие глицеролкиназу, наносят на колонку с ДЭАЭ-сефарозой и элюиру- ют с нее 0,5 М раствором NaCl. 3 ил. 1 табл. i (О

54,3 10,90,2100

129,60,888

0,2 94582

0,12 7,86572

ание. Белок определяют по Лоури.

1 4

225 325

2 SO

7 9 11 13 Г5 11 13 Фиг. /

ШУо

50%

56 7 8 3 ЮрН Фиг. г

Vff

o

0.5

6 7 8 3 Ш f1 pH Фиг. 3

j-t ,1