Способ получения окрашенного субстрата для определения полигалактуроназной активности Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/34 

Изобретение относится к энзимоло- гии, микробиологии, микробиологической и пищевой промышленности, а именно к способам определения активности ферментов.

Цель изобретения - удешевление субстрата, сокращение длительности и упрощение процесса получения окрашенного пектинового вещества.

Окрашенный субстрат согласно изобретению получают путем окрашивания пектинового вещества (пектин, пек- товая кислота) с последующим осажде- .нием целевого продукта и его отделением от несвязанного красителя многократным вымыванием органическим растворителем. В качестве красителя используют активный краситель винил- сульфонового ряда (активный ярко-оранжевый ЖТ, Ремазол ярко-синий Р) в количестве 50-500% от массы пектинового вещества, а окрашивание осуществляют при 30-80°С в присутствии мочевины в концентрации 0,5-8 М в реакционной смеси при рН 11,0-11,5.

Применение активного винилсульфо- нового красителя в присутствии мочевины для окрашивания пектина позволяет проводить процесс окрашивания за 0,25-1 ч. Это объясняется тем, что активные винилсульфоновые группы красителя непосредственно образуют ковалентные связи с гидроксильными группами пектина в щелочной среде в

сл

00

CD 00

присутствии мочевины. Поскольку окра- шиваиие пектина винилсульфоновым красителем осуществляют в сильнощелочной среде (рН 11,5) в присутствии мочевины, способ позволяет исключить гомогенизацию пектина перед окрашиванием.

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. К 500 мл дистиллированной воды при перемешивании небольшими порциями добавляют 14 г цитрусового пектина, 15 г мочевины (0,5 М) и 7 г (50%) активного красителя ярко-оранжевого /КГ, Полученную реакционную смесь нагревают на водяной бане до 50°С и инкубируют 1 ч, после чего доводят рН среды до 11,5 0,1 н. раствором едкого натра и перемешивают при той же температуре 0,25 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выпивают в 1000 мл ацетона. Образовашийся желеобразный осадок перемешивают 20 мин и отжимают через капроновую ткань. Массу отжатого продукта заливают 1000 см 50%-ного раствора ацетона (по объему), перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, осадок продукта отстаивают в течение 20 мин, надосадочную жидкость сливают, а продукт отжимают через капроновую ткань. Отмывку несвязанного красителя повторяют еще раз, после чего промывают окрашенный продукт ацетоном и высушивают в сушильном шка фу при 70°С в течение 10ч. Получают 10 г субстрата в виде оранжевого порошка, хорошо растворимого в воде. Коэффициент экстинкции 1%-ного раство

ра субстрата Е 3,9.

/о Пример 2. При-перемешивании

маленькими порциями добавляют в 500 см дистиллированной воды 14 г свекловичного пектина, 150 г (ЗМ) мочевины и 28 г (200%) активного красителя ярко-оранжевого ЖТ. Полученную реакционную смесь нагревают на водяной бане до 65°С и инкубируют 1 ч, после чего доводят рН среды до 11,0 0,1 н„ раствором едкого натра и перемешивают при той же температуре 0,5 м Осаждение окрашенного продукта и отмывку несвязанного красителя проводят так же, как в примере 1. Получают 10 г субстрата Коэффициент экстинкции раствора субстрата Е4, 6,0.

Пример 3. При перемешивании маленькими порциями в 500 см дистиллированной воды добавляют 14 г пекто

новой кислоты (полигалактуроновая кислота) фирмы Serva, 240 г (8М) мочевины и 70 г (500%) активного красителя Ремазола ярко-синего Р. Полученную реакционную смесь нагревают на водяной бане до 80°С и инкубируют 1 ч, после чего доводят рН среды до 11,3 0,1 н раствором едкого натра и переJQ мешивают при той же температуре 1 ч. Далее выделение продукта и его отмывку проводят так же, как в примере 1. Получают 10 г окрашенного субстрата в виде синего порошка, растворимого

f,j в воде. Коэффициент экстинкции 1%-но

20

25

30

35

40

45

55

50

го раствора Е 5,6.

Пример 6. Определение поли- галактуроназной активности.„

В две пробирки наливают по 4 см 1%-ного раствора субстрата в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5 и термоста- тируют 5 мин при 4О С. В одну пробирку приливают 1 см ферментного раствора пектиназы из A. niger фирмы Serva с концентрацией 0,1 мг/см или полигалактуроназы из Zygofabospo-i- га marxiana 848 с концентрацией 0,75 мг/см3, в другую - 1 см3 буфера (контроль) и инкубируют при 40°С в течение 20 мин, после чего е каждую пробирку добавляют 5 см этанола. Реакционную смесь взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр (красная лента) . Измеряют оптическую плотность полученного фильтрата против контроль- ной пробы при длине волны 490 или 595 нм (в случае субстрата, полученного-no примеру 3) Полигалактуро- назную активность (ПГА) определяют по формуле

ПГА --; -1000, ш-1

где D - оптическая плотность фильтраТЭ;,

V -- объем реакционной смеси, см

(5 см3);

t - время гидролиза, мин (20 мин); m - количество ферментного препарата, взятого для анализа,мг| 1000 коэффициент пересчета ферментативной активности на 1 г препарата.

За единицу ПГА принимают такое количество феомента,, . которое за 1 мин приводит к увеличению оптической плотности фильтрата реакционной смеси на одну оптическую единицу. I

В таблице приведены данные, свидетельствующие о пригодности субстратов, полученных согласно способу, для определения полигалактуроназной активности .

страта, коэффициент экстинкции 1%-но- го раствора Е. 5,9.

Изобретение относится к энзимологии, микробиологии, микробиологической и пищевой промышленности, а именно к способам определения активности ферментов. Цель изобретения - удешевление субстрата, сокращение длительности и упрощение процесса получения субстрата. Способ осуществляют путем окрашивания пектинового вещества активным красителем винилсульфонового ряда (активный ярко-оранжевый ЖТ, Ремазол ярко-синий Р и др.) в количестве 50-500% от массы пектинового вещества при 30-80°С в присутствии мочевины в концентрации 0,5-8 М в реакционной смеси. 2 з.п.ф-лы, 1 ил., 1 табл.

На чертеже показана зависимость скорости гидролиза окрашенного пектина, полученного по примеру 2, от концентрации ферментного раствора пек- тиназы из A.niger. Эту зависимость определяли по описанной методике определения полигалактуроназной активности. Как видно из чертежа прямолинейная зависимость оптической плотности (D460) OT концентрации фермента сохраняется до 0,6 оптической плотности и обеспечивает вполне достаточный интервал для определения полигалактуроназной активности.

Формула изобретен

IQ туроназной активности, включающий ковалентное присоединение к пекти вому веществу азокрасителя с посл дующим выделением целевого продукт путем осаждения и отделением несвя

15 за иного красителя, отличающийся тем, что, с целью удеше ления субстрата, сокращения длител ности и упрощения процесса, в каче стве красителя используют активный

Пример k. Окрашивание цитру- 20 краситель винилсульфонового ряда,

сового пектина активным красно-коричневым РКТ, осаждение продукта и отмывку несвязанного красителя проводят аналогично примеру 3. Получает 10 г субстрата. Коэффициент экстинкции 1%-ного раствора Е 6,.

Пример 5. Окрашивание цитрусового пектина активным бордо СТ и выделение продукта проводят так же, как в примере 2. Получают 10 г субФормула изобретения

краситель винилсульфонового ряда,

взятый в количестве 50-500 от массы пектинового вещества, а окрашивание осуществляют в присутствии мочевины при рН 11-11,5.

при 50-80°С.

0.1

0.15 нон ц, рермен/п& мг/см3