Способ определения антигенов и антител Советский патент 1987 года по МПК A61K39/00 G01N33/535 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано для одновременного опеределения 2-х антигенов или 2-х антител в одном опыте иммуноферментного анализа.

Цель изобретения - увеличение числа определяемых в одной пробе антигенов или антител за счет использования 2-х конъюгатов с различными ферментами.

Способ осуществляется следующим образом.

На полистироловую твердую фазу (пробирки, микротитровальные плашки) адсорбируют антиген (Аг) или антитела (Ат), инкубируют с исследуемой пробой, содержащей Ат или Аг, затем вносят смесь специфических конъюгатов соответственно Аг или Ат со щелочной фосфатазой и пероксидазой, делее вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы, колориметрических определяют поглощение проб и концентрацию одного Ат или Аг, затем твердую фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы по оптической плотности которого определяют концентрацию второго Ат или Аг.

Пример. Определяют изоти- пнческую и антигенную специфичности иммунного ответа in vitro с помощью разработанной тест-системы с двойной иммуноферментной меткой.

Объектом исследования служат су- пернатанты 5-дневных культур клеток селезенки мъшей линии СВА, иммунизированных in vitro гаптеновой группировкой динитрофенилом (ДНФ), сорбированной на полистироле через неиммуногенный аминокислотный спей- сер (аланин или глицин). Тест-антигеном служит ДНФ-БГГ с эпитопиой плотностью гаптена 30 на одну молекулу БГГ. В этих опытах двойная метка используется для выявления соотношения антител IgM/ IgG изотипов при первичном иммунном ответе на искусственный антиген.

Применение тест-системы с двойной иммуноферментной меткой для изучения иммуннопо ответа на гаптеновую группировку ДНФ in vitro приведено с таблице.

Постановка тест-систем с двойной иммуноферментной меткой включает приготовление иммуносорбентов. Антигенный сорбент готовят пассивной

5

0

5

0

сорбцией ДНФ-БГГ на полистироле (10 мкг/мл конъюгата в PBS в течение 18 ч при 4°С); аффинный сорбент включает сорбцию белка А стафилококка в той же концентрации и в тех же условиях. Дополнительно незаполненные сайты полистирола пассивируют 1%-ным раствором;БСА. Все операции сопровождают промывкой панелей водопроводной водой и водой с 0,05- ным Твин-20.

.Вносят исследуемые культурные жидкости в объеме 50-100 мкл, инкубируют 45-60 мин, при , отмывают.

Вносят смеси конъюгатов (анти- IgM - щелочная фосфатаза, анти- IgG - пероксидаза или пероксидаза - анти - IgG - щелочная фосфатаза, в зависимости от задач опыта).

Постедовательно обрабатывают энзим-субстратами п - нитрофенилфос- фатом и 5 - аминосалициловой кислотой с определением соответственно уровня иммунных реагентов, связанных с соответствующим ферментом как визуально, спектрофотометрически.

Таким образом, в одном опыте уда- атся установить изотип синтезируемых нтител..

Формула изобретения

Способ определения антигенов и антител, включающий сорбицию антител или антигенов на твердой фазе, связанные ими соответствующих алтиге- нов или антител из жидкой фазы, обработку полученных комплексов иммуноферментным конъюгатами с последующим определением количества антигена или антител по интенсивности окрашивания хромогенного субстрата, отличающий с.я. тем, что,

с целью увеличения числа определяемых в одной пробе антигенов или антител, используют смесь специфических иммуноферментных конъюгатов антител или антигенов с пероксидазой и щелочной фосфатазой, при этом определение количества антигенов или антител осуществляют путем последовательного внесения хромогеиного субстрата, для щелочной фосфатазы,

регистрации интенсивности окрашивания, отмывания первого субстрата и внесения хромогенн5го субстрата для пероксидазы и повторной регистрации интенсивности окрашивания.

Первичньп иммунный ответ на гаптен ДНФ

Редактор И.Горная

Составитель М.Йасильев

Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга

Заказ 63/7 Тираж 596Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

18/9«

29/98

24/98

26/98

Изобретение относится к иммунологии и предназначено для одновременного определения 2-х антигенов . в одном опыте иммуноферментно- го анализа. Цель изобретения - увеличение числа определяемых в одной пробе антигенов или антител за счет использования 2-х коньюгатсв с различными ферментами. Для этого на полистироловую твердую фазу адсорбируют антиген (Аг) или антитела (Ат), инкубируют с исследуемой пробой, со-, держащей Аг или Ат, затем вносят смесь специфических коньюгатов соответственно Аг или Ат со щелочной фос фатазой и пероксидазой, далее вносят хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы, колориметрически определяют концентрацию одного Аг или Ат, затем твердую .фазу отмывают и вносят хромогенный субстрат для пероксидазы, по оптической плотности которого определяют концентрацию второго Аг или Ат. Таким образом, в одном опыте удается установить изотип синтезируемых антител и антигенов. 1 табл. с (Л