Способ оценки токсичности водных сред Советский патент 1987 года по МПК A01K61/00 

11292684

Изобретение относится к биологиескому мониторингу, а именно к спообам оценки токсичности (загрязнепоры пр кр от то ле па Ма с му ля из Хо ся ло мо эт та чи че ре ва По ла а шт в вл ро в

ия) вод, и может быть использовано в санитарной гидробиологии, водной токсикологии, рыбохозяйственной практике и при медикобиологических исслеованиях.

Цель изобретения - ускорение оценки, повышение ее точности и надежности, а также во аможность прогнозирования выживаемости рыб в исследуеых средах и их смертности.

Предлагаемый способ позволяет использовать рыб как удобную модель в биоиндикации и биотестировании природ ных водоемов для изучения многих физиологических и патологических про- цессов.

На фиг, 1 и 2 показаны кривые зависимости смертности рыб в растворах токсических веществ группы фенола для таких рыб пресноводных водоемов, как Phoxinus phoxinuS; Cottus (Leo- cottus) Pessleri Dyb. и Cottoraraepho- rus greuinki Dyb; на фиг. 3 - зависимость времени гибели 50% особей тех же видов рыб в растворах те же токсикантов от содержания микролимфоцитов и мезолимфоцитов.

Сущность способа оценки токсич- iiocTH водных сред состоит в том, что рыб предварительно выдерживают для

после посадки в токсический раство рыб). Изготовление мазков считают правильным, когда мазок не достига края стекла, заканчиваясь в 1,5-2 с от него. Окраску и фиксацию препар тов производят сразу после изготов ления и просушки мазка. Свежие пре параты крови фиксируются растворами Май-Грюнвальда и Лейшмана (3-5 мин с окраской азурзозином по Романовс му Гимза в течение 20-30 мин, разб ляя азурзозин дистиллированной вод из расчета 1 капля красителя на 1 м Хорошо окрашенные препараты получаю ся в том случае, если реакция воды (рН) будет нейтральной или слабощелочной. Величину рН определяют с п мощью кристаллов гематоксилина. Дл этого в пробирку наливают не более 10 мл воды и бросают в нее 1-2 кри талла гематоксилина. Если вода начинает окрашиваться не раньше, чем через 1 мин, и не позже, чем через 5 мин, она пригодна для работы.Если реакция кислая, ее можно нейтрализ вать 1%-ным раствором питьевой соды После окраски препараты хорошо опо ласкивают сначала дистиллированной а затем простой водой и ставят в штатив для просушки. Дифференцированный подсчет формулы крови осуще вляет под обыкновенным световым ми роскопом МБИ-1, МБИ-2 и др. Исслед вание мазков крови проводится как

адаптации к условиям содержания в течение 10 сут. После зтого их помещают 35 при дневном свете, так и с освети- в аквариумы с исследуемой средой при телями ОН-24, ОИ-7 и др. плотности посадки не более -1 шт/л Выбираются наиболее удачно и температуре среды, соответствующей температуре среды их обитания. Содержание кислорода должно составлять 7-9 мг/л. Токсический раствор (среду) в аквариумах заселяют один раз в сутки. Для опытов берут рыб из условно чистых в отношении загрязнения зон водоемов. Рыб вьщерживают в исследуе- 5 мой среде в течение 3 суР. Выбор времени обусловлен тем, что более большой срок ожидания приводит к непосредственной гибели рыб и при зтом теряется смысл прогнозирования,, а уменьше- 50 ние срока выдерживания рыб приводит к чрезмерно неточному прогнозу смертности. После выдерживания у рыб берут пробы крови. Для одного анализа беокр

шенные препараты. Применяется иммер сионньй объектив. Наибольшая четко достигается при окуляре х 7. Для п счета лейкоцитов используют восьми клавишную счетную машинку. Подсчиты вают все встречающиеся в поле зрения форменные элементы крови. Подсч начинают с середины мазка.

Вьщеление микро- и мезолимфоцитов производят по признакам, обозна ченным в таблице.

Название признаков

Характеристика признаков Микролимфоцит Мезолимфоц 2-4 мкм 4-7 мкм

рется 5 шт. рыб. От каждой рыбы берется по 4 мазка крови из хвостовой артерии путем отсечения хвостового стебля в утренние часы (через 3 ч

0

s

0

5

30

после посадки в токсический раствор рыб). Изготовление мазков считают правильным, когда мазок не достигает края стекла, заканчиваясь в 1,5-2 см от него. Окраску и фиксацию препаратов производят сразу после изготовления и просушки мазка. Свежие препараты крови фиксируются растворами Май-Грюнвальда и Лейшмана (3-5 мин) с окраской азурзозином по Романовскому Гимза в течение 20-30 мин, разбавляя азурзозин дистиллированной водой из расчета 1 капля красителя на 1 мл. Хорошо окрашенные препараты получаются в том случае, если реакция воды (рН) будет нейтральной или слабощелочной. Величину рН определяют с помощью кристаллов гематоксилина. Для этого в пробирку наливают не более 10 мл воды и бросают в нее 1-2 кристалла гематоксилина. Если вода начинает окрашиваться не раньше, чем через 1 мин, и не позже, чем через 5 мин, она пригодна для работы.Если реакция кислая, ее можно нейтрализовать 1%-ным раствором питьевой соды. После окраски препараты хорошо ополаскивают сначала дистиллированной, а затем простой водой и ставят в штатив для просушки. Дифференцированный подсчет формулы крови осуществляет под обыкновенным световым микроскопом МБИ-1, МБИ-2 и др. Исследование мазков крови проводится как

35 при дневном свете, так и с освети- телями ОН-24, ОИ-7 и др. Выбираются наиболее удачно 5 50

при дневном свете, так и с освети- телями ОН-24, ОИ-7 и др. Выбираются наиболее удачно

окр ашенные препараты. Применяется иммер- сионньй объектив. Наибольшая четкость достигается при окуляре х 7. Для счета лейкоцитов используют восьми- клавишную счетную машинку. Подсчитывают все встречающиеся в поле зрения форменные элементы крови. Подсчет начинают с середины мазка.

Вьщеление микро- и мезолимфоцитов производят по признакам, обозначенным в таблице.

35 при дневном свете, так и телями ОН-24, ОИ-7 и др. Выбираются наиболее уд 5 50

Название признаков

55 Диаметр клетки (без отростков)

Характеристика Микролимфоцит 2-4 мкм

с еле заметны- . )0 ми отростками (до 2-3).Форма клетки определяется формой ядра15

Ядро выпукло- Ядро круглое вогнутое (бобовидное) ,иногда круглое20

Темно-вишневый Светло-вишневый

Располо- Плотное,компа- Неплотное жение ктное располо- расположение хромати- жение, с гру- на быми тяжами.

После подсчета микро- и/или мезо- лимфодитов определяют их среднее процентное содержание от общего количества лейкодитов в препаратах от 5 рыб (по 4 препарата от каждой рыбы). Полученные значения сравнивают а заранее составленными калиб- ровочньвми кривыми (для данного вида или видов рыб), которые отражают зависимость смертности рыб соответственно на 24 ч и 8 сут и гибели 50% особей рыб от процентного содержания микро- и/или мезолимфоцитов.

Калибровочные кривые (фиг.1, 2 и 3) строят заранее по указанной схеме: выдерживают предварительно избра ный вид рыб в чистой воде строго определенное количество дней. Затем перемещают этих рыб из аквариумов с чистой водой в аквариумы, в каждом из которых есть определенная концентрация одного и того же токсического вещества. Через 3 ч после помещения рыб в растворы токсических веществ у части рыб, которых вьшодят из эксперимента (обычно 5 шт, из каждого аквариума с одной и той же концентрацией токсиканта), берут кровь на анализ. По количеству рыб из осташейся части определяют их смертность

)0 15

0

5

0

5

0

0

5

(в %) при каждой концентрации на 24 ч, 8 сут и т.д. Строят график,где на оси абсцисс откалывают величину смертности рыб (в %) на данный момент времени (например 8 сут), а на оси ординат с одной стороны графика - количество микролимфоцитов (в %) за 3 ч (после начала токсического воздействия), а с другой стороны графика - количество мезолимфоцитов (в %) на 3ч. Аналогичные графики строят для других видов рыб, при этом токсикологические опыты с каждым видом проводятся отдельно.Все данные для разных видов рыб обычно объединяют в одном графике для значений смертности на 24 ч или 8 сут и т.д. При этом наносят на график в виде точек реальные данные для разных видов рыб (фиг. t и 2). Затем ограничивают область, в которой помещаются нанесенные на график 95% точек, сверху и снизу двумя линиями, показывающими интервалы, в которых меняются показатели. Эти линии проводят приблизительно (на глаз), но так, чтобы обе они были примерно на одинаковом расстоянии от воображаемой линии для средних величин показателей оси ординат. Например, на фиг. 2 среднее значение количества микролимфоцитов в 85% наблюдается при смертности 0%, а 65% микролимфоцитов - при смертности 50%. В этом случае при смертности 0% обе линии проходят на одинаковом расстоянии сверху и снизу от значения 85% микролимфоцитов (т.е. на уровне 93 и 77% микролимфоцитов), а при смертности 50% на одинаковом расстоянии сверху и снизу от значения 65% микролимфоцитов (т.е. примерно на уровне 73 и 57% микролимфоцитов).

Интервалы значений, в которые помещаются показатели смертности рыб (для фиг. 1 и 2 около ±20 и ±15%), тем шире, чем для большого числа рыб построены-калибровочные кривые. Если калибровочные кривые строят только для одного вида рыб , то интервалы смертности, как правило, будут меньше указанных, но даже большие погрешности в ±15 и 20% смертности способствуют повышению точности анализа, поскольку он по сравнению с существующими позволяет дать количественный прогноз смертности рыб в исследуемой среде.

На графиках фнг. 1-3 верхняя и нижняя кривые указывают соответственно на минимальные и максимальные значения смертности всех трех приведенных видов рыб при данном числе соот- ветствующих видов клеток.

Искомая средняя величина смертности всех видов рыб лежит посредине интервалов, изображенных на графи- jKax фиг. 1-3. Два места пересечения перпендикуляра (к оси ординат) с верхней и нижней кривой каждого графика дают соответственно максимальные и минимальные значения смертности.

При осуществлении способа можно выявлять только микролимфоциты или только мезолимфоциты и определять токсичность по ним. Если же имеется возможность выявить оба вида клеток, то определяют смертность рыб и ток- сичность водной среды по средней величине смертности, полученной посредством подсчета каждого вида клеток, при этом обеспечивается большая надежность. Предлагаемый способ позволяет по состоянию микро- и мезолимфоцитов вскоре после начала токсического воздействия определять уровни токсичности водной среды, лучшим критерием которого явля- ется степень выживаемости рыб.

Способ основан на закономерности, отражающей связи между соотношением микро- и/или мезолимфоцитов в первые

часы после попадания рыб в токсичес- гибель 50% всех рыб - 15+10 сут.Проверка показала, что на соответствующие периоды времени гибель рыб составляет соответственно 1В и 34%. ; Пример З.В исследуемую водную

кую среду, и показателями выживаемости рыб в последующие дни, недели и месяцы после начала токсического воздействия.

Пример 1. В 100-литровый ак-40 среду (раствор ортокреозола концентрацией 0,1 мг/л) помещают рыб вида Cottoromephorus greuinli Dyb. Остальные приемы, как в примере 1. Содержание мезолимфоцитов - 30%. По гра45 фикам фиг. 1-3 находят, что на 24 ч и 8 сут гибель рыб составляет 36±13% и 58+18%, а 50% всех рыб погибнет на 6+6-е сутки. Проверка показала, что на соответствующий период времеJQ ни гибель рыб составляет соответственно 30 и 50%.

Пример 4. В исследуемую водную среду (раствор гваякола концент- рацией 10 мг/л) помещают рыб вида

55 Cottus (Liocottus) Resslere Dyb.Определение содержания микролимфоцитов - 69%, мезолимфоцитов 16%. По графикам фиг. 1-3 находят, что если судить по числу микролимфоцитов, то на 24 ч

вариум с исследуемой водной средой помещают рыб вида Phoxinus phoxinus. В качестве водной среды используют раствор гидрохинона концентрацией 0,01 мг/л. Рыб выдерживают в течение 3 ч, после чего берут пробы крови и подсчитывают количество микролимфоцитов и их процентное содержание от общего количества лимфоцитов, в результате которого получена цифра 80%.

. По заранее построенным кривым, изображенным на фиг. 1-3, устанавливают, что согласно графика на фиг.1 максимальное значение смертности на 24 ч 20%. Нижняя линия графика не дает никакого значения смертности, так как перпендикуляр к оси ординат (в точке, соответствующей 80% микро

лимфоцитов) с нижней линией не пересекается, поэтому величина смертности на 24 ч может изменяться от О до 20%, следовательно, среднее значение составляет О ±20%.

Аналогично определяют смертность рыб на 8 сут по графику на фиг.2 и гибель 50% рыб по графику на фиг.З, которые соответственно составляют 20 +20% и 60+40 сут. Проверка способа показала, что на соответствующи период времени гибель рыб составляет 2 и 8%, а 50% рыб гибнет на 60-е сутки. Таким образом, способ обладает достаточной достоверностью.

Пример 2. В исследуемую водную среду (раствор гваякола концентрацией 10 мг/л) помещают рыб Cot tus (Liocottus) Resslere Dyb. и вьщержи- вают их в течение 3 ч, после чего у рыб берут пробы крови и подсчитывают как количество микролимфоцитов, так и их процентное содержание, которое составляет 69%.

По графикам на фиг. 1-3 устанавливают, что на 24 ч максимальное значение гибели рыб составляет 35% (верхняя кривая), а минимальное - 5% (нижняя кривая), среднее значение

35% + 5%

смертности на 2,4 ч

20%.

Среднее с допуском значение 20+-15% . Точно так же определяют значение смертности на 8-е сутки - 35+16% и

и 8 сут гибель рыб составит соответственно 20+15% и 36±16%, а 50% всех рыб погибнет на 15±10-е сутки. Если же судить по числу мезолимфоцитов, то гибель рыб составит соответственно 15+15% и 33+16%, а 50% всех рыб йогибнет на 21±13 сутки. Средние величины гибели рыб по данным о числе микро- и мезолимфоцитов одновременно соответственно составят:

20%+ 15%

17,5%

и

36% + 33%

34,5%,

пI , /о iiл

15+21 а 50% всех рыб погибнет на (сут)

18 сут. Проверка показала, что на co-j ответствуюций период погибает 18 и 34% рыб, а 50% рыб гибнет на- 20-е сутки.

Предлагаемый способ позволяет процентное содержание от общего колиличить скорость оценки токсичности в 4 раза при определении острой токсичности и более чем в 100 раз при определении слабой токсичности, что определяется возможностью учета коли- 25 чественных изменений мезо- и микро- лимфоцитов в сосудистом русле рыб, поскольку последние являются более лабильными и чувствительными критеричества лейкоцитов, а для определения токсичности сравнивают полученные данные с предварительно построенными калибровочными кривыми, отра- жакнцими зависимость между процентным содержанием мезолимфоцитов и/или микролимфоцитов у исследуемых видов рыб и их смертностью, а также длительностью жизни 50% рыб.

0

ями морфофункционального состояния организма рыб.

Формула изобретения

Способ оценки токсичности водных сред, предусматривающий выдерживание в исследуемой среде рыб, взятие у них проб крови, анализ пробы с подсчетом лейкоцитов и определение токсичности по полученным данным, отличают щ и и с я тем, что, с цадью ускорения оценки повьппения ее точности, а также возможности прогнозирования выживаемости рыб в исследуемых средах, выдерживание рыб осуществляют в течение 3ч, при анализе крови наряду с лейкоцитами ведут подсчет мезолимфоцитов и/или микролимфоцитов, после подсчета устанавливают их среднее

чества лейкоцитов, а для определения токсичности сравнивают полученные данные с предварительно построенными калибровочными кривыми, отра- жакнцими зависимость между процентным содержанием мезолимфоцитов и/или микролимфоцитов у исследуемых видов рыб и их смертностью, а также длительностью жизни 50% рыб.

Изобретение относится к биомониторингу. Изобретение позволяет ускорить оценку токсичности, повысить ее точность и дает возможность прогнозирования выживаемости рыб в исследуемых средах. Рыб помещают на 3 ч в исследуемую среду и берут пробу крови. При анализе пробы подсчитывают лейкоциты и микро- и/или мезолим- фоциты. Определяют среднее процентное содержание последних от общего количества лейкоцитов. О токсичности судят, сравнивая полученные данные с предварительно построенными калибровочными кривыми, отражающими зависимость между процентным содержанием мезо- и/или микролимфоцитов и их смертностью и длительностью жизни 50% рыб. 3 ил. 1 табл. S to со to О) 00 4ib

20 0SQ

Смертности на 2 часа % Фи. 1

20

W

Смертность на gS сутки % Фи9.2

30

ffO

50% особей, cymttu Фие.З

30

ffO

Редактор Э. Слиган

Составитель С. Филиппова Техред МДоданич Корректор Т.Колб

Заказ 300/1Тираж 630Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4