Способ определения стресс-реакции Советский патент 1992 года по МПК G01N33/58 A61K47/00 

1 .

(21)4489405/14 (22)03.10.88 (46)23.12.92. Бюл. №47

(71)Свердловский государственный медицинский институт

(72)О.Г.Макеев, И.В.Ясырева и А.В.Короткое

(56)Авторское свидетельство СССР

№ 1293651, кл. G 01 N 33/58, опублик. 1987.

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРЕСС-РЕАКЦИИ

(57)Использование: физиология, медицина. Целью изобретения является повышение точности Способа. Сущность изобретения: в

качестве инкубационой среды эритроцитов с мечеными биологически активными веществами (БАВ) используется околоклеточная среда органов и тканей, в которых происходит эритроцитарный обмен БАВ. При этом околоклеточная среда, взаимодействуя с эритроцитами, вызывает отсоединение БАВ, активно используемых тканями (и недостаток которых имеется в среде), и присоединение к эритроцитам БАВ, имеющихся в околоклеточной среде в избытке, что моделирует условия обмена БАВ в тканях. По окончании инкубации эритроциты отмывают от инкубационной среды и радиометри- руют. 5 табл.

Изобретение относится к медицине и физиологии, а именно к методам исследования эритроцитарных транспортных систем.

Известны способы оценки стресс-реакции путем определения объема кровотока через голбвпой мозг и константы скорости потребления кислорода тканями мозга, анализа электрокардиограммы.

Наиболее близким к изобретению является способ определения реакции организма на воздействие стрессорных факторов, основанный на определении в крови кислой фосфатазы, катепсина Д и щелочной фосфа- тазы в периоды относительного функционального покоя и действия стрессора. При повышении активности ферментов в условиях стресса менее чем на 20% устанавливают нормальную реакцию организма, а при увеличении более чем на 20% - патологическую реакцию.

Недостатком способа является низкая точность оценки. Последнее обусловлено широкими пределами колебания концентрации ферментов в зависимости от возраста, режима питания, наличия заболеваний, в том числе хронических, групп крови (Клиническая оценка лабораторных тестов/Под ред. Н.У.Тица. М.: Медицина, 480 с).

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что в способе, включающем исследование биологически активных веществ (БАВ) крови, эритроциты помещают в биологические жидкости организма, в которые дополнительно вносят меченые БАВ, и при определении отношения приращения связывания с эритроцитами БАВ менее 0,63 устанавливают начальную стадию стресс-реакции, а при значении более 1,37 устанавливают стадию поврежде ния клеточных момбран.

х| 00 W

4

6

Увеличение точности способа происходит за счет того, что начальная стадия стресс-реакции, сопровождающаяся изменением состава и свойств биологических жидкостей, вызывает снижение взаимодействия эритроциты-меченые БАВ, а развитие стресс-реакции, сопровождающееся повреждением клеточных мембран (повреждение липидного бислоя), приводит к повышению взаимодействия эритроциты - меченые БАВ (в результате увеличения неспецифического компонента взаимодействия).

В осуществлении способа используются БАВ, принимающие активное участие в процессах адаптации и компенсации повреждения - кортикостероиды и простаг- ландин Е2 (ПГЕа).

Способ осуществляется следующим образом.

На 1 этапе определяют характеристики эритроцитов и сыворотки интактных доноров. Эритроциты получают посредством центрифугирования интактных доноров. Эритроциты получают посредством центрифугирования стабилизированной крови и помещают в 0,4 мл биологической жидкости (сыворотки, околоклеточной жидкости), полученной от интактных доноров, в которую внесены меченые кортикостероиды и ПГЕ2 в концентрациях 10 -109 моль для ПГЕ2 и кортикостероиды и 10 10-10 s моль. Основное требование при проведении этого этапа - предварительное тестирование крови людей по системе АВО. Спустя 30 мин инкубации этой смеси при 37°С эритроциты отмывают от несвязанного лиганда на мил- липоровых фильтрах. Фильтры высушивают и радиометрируют в простом толуоловом сцинтилляторе. На основании полученных данных строят график зависимости количества связавшегося вещества (ось ординат) от концентрации внесенного в инкубационную среду (ось абсцисс).

На построенном графике определяют место перегиба, необходимость выявления которого обусловлена тем, что этой точке соответствует насыщение специфических к данному радиолиганду участков связывания. Дальнейшее связывание (после насыщения специфических участков) обусловлено неспецифическими процессами (липофильностью и гидрофобностью БАВ), химическими и физическими свойствами мембраны.

Таким образом, смещение точки перегиба свидетельствует об изменении концентрации данного БАВ в окружающей клетку среде, которое вступает в конкуренцию с меченым аналогом за места специфического связывания. Полученная концентрация и превышающая ее на порядок в дальнейшем используются для оценки стадии стресс-реакции. Дополнительная концентрация (на

порядок большая) необходима для оценки неспецифического связывания, которое в основном зависит от химического состава мембран, неменяющегося под действием стресса.

0 Эритроциты и сыворотку, исследованные на 1 этапе, сохраняют в течение 2-3 недель при 1-4°С и используют по мере необходимости на 2 этапе. Экспериментальным путем определено, что исследованные

5 показатели при хранении в этих условиях в течение 3 недель не изменяются.

Проведением 1 этапа (определение концентрации радиолиганда) достигается существенное повышение точности оценки

0 стресс-реакции благодаря исключению погрешностей, связанных с индивидуальными особенностями доноров и качеством использованных в работе реактивов.

На 2 этапе готовят 2 серии инкубацион5 ных культур:

1серия - эритроциты здоровых доноров (заготовлены на 1 этапе), биологическая жидкость обследуемых;

2серия - эритроциты обследуемых, би- 0 ологическая жидкость здоровых доноров

(заготовлена на 1 этапе).

В каждой серии исследуется связывание с эритроцитами меченых ПГЕ2 и корти- зола (кортикостерона у лабораторных

5 животных, что обусловлено особенностями их эндокринной регуляции) в концентрациях, определенных на 1 этапе, которые до- бавляются в среде перед внесением эритроцитов. Режимы инкубации и последу0 ющей радиометрии аналогичны 1 этапу. На основании полученных данных рассчитывают отношение приращений связывания ли- гандов в 1 и 2 серия,х по отношению приращений связывания лигандов, пол5 ученных на 1 этапе (эритроциты и сыворотка интактных доноров). При возрастании концентрации меченого БАВ, в среде инкубации на порядок определяют разницу отношений приращений для двух концент0 раций в 1 и 2 сериях. Выявляют вещество, для которого эта величина окажется наименьшей, и на основании этого производят оценку стадии стресс-реакции. Выполнение подобной процедуры приводит к некоторо5 му загрублению метода, однако подобный подход оправдан, так как позволяет снизить влияние случайных факторов на результат, что ведет к повышению точности способа (Горелик Л.А. и др. Методы распознавания.

М.: Высшая школа, 1989, с. 99-111).

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Возраст обследуемых от 20 до 50 лет. По предлагаемому способу обследовано 120 рабочих.

Первый этап исследования. Кров здоровых доноров получали со станции переливания крови. Полученную кровь тестировали по системе АВО и резус-фактору. Эритроциты из цельной крови получали центрифугированием (3,5 тыс. об/мин, 15 мин), дважды отмывали растворов Хенкса при тех же режимах центрифугирования. Отмытые эритроциты суспендировали в растворе Хенкса по 25 -10 клеток в 50 мкл среды, залибали их в пластмассовые трубы и для хранения помещали в холодильник при 1-4°С.

Сыворотку крови от здоровых доноров фильтровали через миллипоровые фильтры с величиной пор 220 нм и помещали в пла- стмассЬвы е трубы в холодильник при 1-4°С.

На 1 этапе сыворотку крови здоровых доноров в объеме 400 мкл помещали в полистироловые платы, в которые вносили меченные по тритию и углероду лиганды (5, б, 8,11,12,14, 153Н-простагландин Е2 фирмы Амершам, молярная активность - 6,43 ТБк/ммоль) в обьеме 50 мкл физраствЬра до конечных Концентраций 500 мкл инкубационной среды Ю 11,2- 1011,4-1011,, 1012, 2- Ю 10, 4- 1010, 8- Ю 10, моль и 414 С-к ортизол (молярная активность 1,8 ТБк/моль, СССР) в объеме 50 мкл до конечных концентраций , 2 , 4- Ю 10, 8 , , 2- , 4- , 8- Ю 9, моль по три пробы каждой концентрации,

Процедура разведения на примере раз- реденмя ПГЕ2.,

Удельная радиоактивность ПГЕа по паспорту составляет 6,48 ТБк/ммоль, объемная радиоактивность флакона по паспорту 3,7 МБк/мл. Радиоактивность фасовки 1,85 МБк. Следовательно, для вычисления объема растворителя, в котором поставляется ПГЕа, необходимо общую активность фасовки разделитьЧ1а объемную радиоактивность (1,85 МБкгЗ, 1 МБк/мл 0,5 мл или 500 мкл). Для определения количества вещества, находящегося в фасовке, общую радиоактивность фасовки разделяют на удельную радиоактивность вещества (1,85 МБк:6,48ТБк/ммоль 0,285;10 ммольили 0,285-Ю 9 моль).

Так им образом, имеется 0,285- 10 моль ПГЕ2. растворенного в 500 мкл абсолютного этанола (растворитель поставки). Необходимо в инкубационной среде с общим объемом 0,5 мл создать концентрацию ПГЕ2 моль(примр). Концентрация М соV14

1C 14 в

0

0

ответствует 10 М в 1 мл или 0,5 0,5 мл. Для решения этой пропорции 0,5- М х 500 мкл: 0,285- ,75 мкл. Следовательно, 0,5- Ю 14 М ПГЕа содержится в 8,75- мкл. Необходимо взять 87- 5 мкл и развести в Ю3 раз. Раз&одение осуществляется поэтапно. На 1 этапе 8,75 мкл исходного раствора разводят 500,0 мкл физраствора, 50 мкл полученного раствора разводят в 0,450 мл физраствора (разведение в 100 раз). При разведении 50 мкл последнего раствора в 450 мкл среды получают конечную концентрацию (разведение в J03 раз) в инкубационной среде, содержагцэй 5 сыворотку, эритроциты и ПГЕа.

По той же схеме рассчитывают другие концентрации.

Радиоактивность полученных концентраций рассчитывают по формуле: количество вещества, умноженное на уд. радиоактивность вещества (0,,48х1015 Бк/моль 32,4 Бк). Следует отметить, что моль вещества соответствует 10 (число Авогардо) Ю9 молекул; таким обра- 5 зом, в 0,5 мл инкубационной среды с концентрацией ПГЕ2 10 моль содержится 10 молекул ПГЕ2.

Расчет радиоактивности используют при проведении очистки ПГЕ2 на колонке, заполненной кремниевой кислотой (ВИР РЕД, США), смесью 0,04 объемных долей метанола и 0,96 объемных долей хлороформа с последующим упариванием и разведением в абсолютном этаноле. В последнем случае пересчитывают на выход с колонки (65%-хО,65).

В каждую ячейку платы заливают 25 -10 эритроцитов (к уже залитым сыворотке и меченому лиганду) в объеме 50 мкл и помещают в термостат при 37°С.

После инкубации клетки осаждают на миллипоровые фильтры (450 нм) и отмывают 25-кратными объемами физраствора, содержащего немеченые лиганды (десятикратно превышающие по концентрации использованные). Фильтры высушивают и радиометрируют в простом толуоловом сцинтилляторе на сцинтилляционном счетчике Бета-2 (эффективность счета по 3Н - 0 57,5%,по14С-97%).

Данные представлены в табл.1.

На основании таблицы строили график зависимости количества связавшегося вещества (ось ординат) от концентрации, вне- 5 сенной в среду инкубации (ось абсцисс) для донора С., 28 лет, III гр. крови, резус +.

На построенном графике определяли место перегиба (для ПГЕ2 - 0,9 М, для кортизола - 10 М).

0

5

0

5

Полученные таким образом результаты являются контрольными для обследуемых, имеющих группу крови III и резус +.

На 2 этапе исследования у обследуемых также получали эритроциты крови (3-кратной отмывкой центрифугированием 3,5 тыс. об/мин, 15 мин), стабилизированной гепарином или цитратом венозной крови, и сыворотку (отстаиванием при 4°С в течение 2 ч и последующим центрифугированием 3,5 тыс.об/мин, 15 мин) нестабилизированной венозной крови.

Полученную от пациентов кровь тестировали по системе АВО и по наличию в крови резус-фактора. При определении III группы крови и резуса + использовали для проведения реакции эритроциты и сыворотку здорового донора С. Кровь обследуемых с иной группой исследовали с эритроцитами и сывороткой здоровых доноров соответствующей группы крови.

. Сыворотку крови рабочего 17. (26 лет, стаж работы 1 год, оператор), имеющего III группу крови и резус + в объеме 0.4 мл, заливали в 12 ячеек пластиковых плат (объем ячейки 1,5 мл) и приливали меченый ПГЕа в концентрациях, определенных на 1 этапе (0,9 - точка перегиба и 0,9 10 - в 10 раз большая), в 6 ячеек и меченый кортизол ( и моль) в 6 ячеек по 3 на каждую концентрацию.

В следующие 12 ячеек заливали сыворотку здорового донора С., в которые аналогичным образом и в тех же концентрациях приливали меченые лиганды (по 3 на каждую концентрацию).

Полистироловые платы разогревали в термостате в течение 5 мин (37°С) и в заполненные ячейки вносили эритроциты: в сыворотку крови обследуемого П. - по 25-10 клеток здорового донора С. в объеме 50 мкл и в сыворотку крови здорового донора С. - 25-106 эритроцитов обследуемого П. (50 мкл).

После 30-минутной инкубации при 37°С эритроциты осаждали на фильтры с величиной пор 450 нм, отмывали 25-кратным объемом физиологического раствора, содержащим в избытке немеченые лиганды. Фильтры подсушивали и помещали в специальные контейнеры, в которых доставляли в лабораторию СГМИ, где радиометрировали на счетчике БЕТА-2. На основании полученных данных составлена табл.2.

Пример расчета поданным рабочего П.: Хопыт 701.1 -662.2 ,04

Хконтроль 740 - 643,0 где 0,4 - отношение приращений связывания ПГЕ2 с эритроцитами донора С. при

инкубации с сывороткой донора П. По отношению к приращению связывания ПГЕ2 с эритроцитами донора С. при их инкубации с сывороткой донора С. (Х0п/ХКонтр).

Хопыт ... 736

Х«жтр 737,1-592,4

«.ЧДИ,

(см. табл.1)

где 1,04 - отношение приращений связывания кортизола с эритроцитами обследуемого П. при инкубации в сыворотке донора С. по отношению к приращению связывания кортизола с Эритроцитами донора С. при их инкубации с сывороткой донора С.

Как следует из полученных данных, в наибрльшей степени изменяется связыва- ние МГЕз; поэтому, с целью повышения до- стове рности, анализ следует проводить по данным изменения связывания кортизола. Достоверные отличия связывания кортизола получены при инкубации эритроцитов донора С. с сывороткой рабочего П (отношение приращений менее 0,63); следо- вательно, сыворотка обследуемого П. оказывает ингибирующее действие на связывание меченого кортизола, что обусловлено избытком немеченого кортизола в сыворотке П. Возрастание концентрации кортизола в сыворотке характерно для начальной стадии стресс-реакции.

Таким образом, обследуемый П. находится в начальной стадии стресс-реакции.

На основании проведенных исследова- кий составлена диагностическая таблица, использование которой значительно упрощает диагностическую процедуру (табл.3).

Пример 2. 1 пациент К., 23 года, 1 производство, слесарь КИП, стаж работы 3 года.

2пациент, П., 38 лет, оператор, стаж работы 3 года.

3пациент С., 24 года, оператор, стаж работы 4 года.

Результаты представлены в табл.4.

Как следует из данных, полученных при исследовании по заявляемому способу 1 пациента (К), наименьшей разницей отношений приращений связывания обладает

меченый ПГЕ2; следовательно, для повышения точности диагностики стадии стресс-реакции целесообразно использовать данные, полученные при инкубации эритроцитов с ПГЕ2. Во всех случаях отношение приращений связывания находится в пределах 0,63- 1,37. Следовательно, стресс-реакция отсутствует.

При обследовании пациента К. по прототипу обнаружено значительное (на 48%)

увеличение кислой и щелочной фосфатаз, что, согласно прототипу, расценивается как наличие стресс-реакции. Противоречие диагностики нашло объяснение в том, что у обследуемого К. при клиническом и лабораторном исследовании выявлен хронический, вялотекущий пиелонефрит, сопровождающийся нарастанием активности ферментов крови.

При обследовании пациента П, наименьшей разницей отношений приращений обладает кортизол, поэтому анализировали связывание эритроцитами кортизола. Изменение связывания кортизола с эритроцитами донора С. при их инкубации с сывороткой пациента П меньше порогового значения (0,63), в то же время изменение связывания кортиэола при инкубации эритроцитов пациента П. с сывороткой здорового донора С. не превышает пороговое значение (1,37).

Следовательно, пациент П. находится в стадии тревоги. Анализ активности ферментов по прототипу показал повышение активности ферментов на 16,3%, что должно рассматриваться как отсутствие стресс- реакции. Однако при клиническом обследовании данного пациента обнаружена анемия неясной этилогии (эритроциты - 3,6 Тлитр, гемоглобин - 92 Глитр), проявлением которой является снижение активности исследуемых ферментов.

Анализ данных, полученных при исследовании крови пациента С., продемонстрировал, что с целью большей достоверности следует использовать данные по связыванию ПГЕа. Оценка этих параметров показывает, что отношение приращений связывания ПГЕ2 с эритроцитами обследуемого С. при инкубации последних в интак- тной сыворотке превышает порог 1,37, что свидетельствует о наличии повреждения клеточных мембран. Важно отметить, что у данного пациента при клиническом исследовании не выявлено соматической патологии, активность ферментов свидетельствует о наличии стресс-реакции (возрастание активности на 61,2%), Последнее совпадает с данными, полученными по данному способу. Подтверждением адекватности диагностики является то, что исследование проведено сразу после ликвидации аварийной ситуации, связанной с выбросом сернистого газа, и работы в средствах индивидуальной защиты (близкие показатели в тот день были получены и у других пациентов).

Следует отметить, что среди обследованных лиц клинически выявлено в 52% случаев обострение хронических заболеваний

или вновь возникших заболеваний, в патогенезе которых важное место занимает стресс-реакция (язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, гипертоническая бо5 лезнь, астено-вегетативный синдром и др.). В эту группу вошло 32 человека, оцененных как находящихся в стадиях стресс-реакции, и 31 человек - в стадии покоя по методу, изложенному в прототипе. В то же время в

0 данную группу (63 человека) вошло 60 человек, у которых обнаружена та или иная стадия стресс-реакции, и 3 человека, состояние которых расценивалось, как состояние покоя по заявляемому способу. Таким обра5 зом, ошибочный диагноз по прототипу был вынесен в 31 случае, или в 49,2%. По предлагаемому способу ошибочное заключение было сделано в 3 случаях, или в 4,7%.

Следовательно, повышение точности

0 заявляемого способа по сравнению с прототипом составляет 44,5%.

Пример 3. В эксперименте использовали мышей линии СВА в количестве 40

5 (самцы, возраст 5-6 месяцев, масса 18-22 г). В ходе эксперимента животных разделяли на 2 группы, у одной из которых вызывали развитие стресс-реакции путем обездвиживания в плексиглазовых трубах в

0 течение 8 ч, другую содержали в обычных условиях (по 20 животных в каждой группе). В ходе эксперимента использовали метод слепого контроля, состоящий в том, что до конца исследования принадлежность живо5 тного к той или иной группе была неизвестна.

В связи с выполнением эксперимента на животных в методику исследований были внесены следующие изменения:

0 1) получение крови и сыворотки производили декапитацией животных;

2) групповая совместимость крови не оценивалась, так как была обеспечена генетической идентичностью линии животных;

5 3) в исследовании вместо 14С-кортизола был использован 3Н-кортикостерон (1, 2 6, 7 3Н4-кортикостерон, молярная активность 2720 ТБк/моль), что связано с особенностью их нефроэндокринной регуляции.

0 4. Для оценки концентрации ферментов были использованы методические приемы, позволяющие исследовать активность ферментов в микроколичествах крови.

На 1 этапе были определены рабочие концентрации меченых БАВ (ПГЕ2 и корти- костерона), которые для мышей линии СВА составили 1,9 , 1,9 Ми 0,8; М соответственно, --; Данные представлены в табл.5.

Выбрав БАВ с наименьшей разницей отношений приращений, кото р ым в том и другом случае является кортийОс ёрбн, и сравнив отношения приращений кортико- стерона в диагностической таблице, можно придти к заключению, что животное № 17 находится в начальной стадии стресё-реак- ции - в стадии тревоги, а животное № 28 - в стадии покоя, Между тем актШность ферментов/определённых в соответствии про- тотипомг по отношению к кЪнТролю составило 16 и 14% соответствий но; чтсГпо- зволяет квалифицировать Их состЪянй как состояние покоя.

Расшифровка протоколов показа/la, что животное Мг 17 относится к группе сйндук- цированной обездвиживанием стресс-реакцией, животное №. 28 - как интактное.

Таким o6 pWo.M,s при диагностике со сто- яния животного № 17 по методу; изложенному в прототипе, допущена ошибка,

Анализ данных всегоШс пер ймента показал, что ошибочное решение при исполь. Данные дли построения к ривой зависимости связыпайия FlTEj и кортизола от количества веществ, внесенных в среду инкубации (здоровый донор С., 28 лет, III гр.крови, резус +). Радйоактивнбстб- 1П рёйбҐав№й в -к;-; УЯ4: чи средних значениях по 3 пробам ---;--;д.лi, ..:- .,.и . :л.

-, -Ч f M jrsp W

, . , . . ,

м - ..

r.f

-, i ; 1

„ f fift t

i, . % - 4f M j I

,..« fijfe i , Л- --

зовании способа, взятого за прототип, принято в 18% случаев, а при использова.нии преДл ага еШр госпособа. - в 5% случаев, сле дОв т ль н пр ьГшенйе томнрсти оценки.

5 стадий W cc-рейцйй ho предлагаемому- способу1 с о ста.вляет, 13 %, чтр, однако, существенно ниже, чем при обследовании людей. /

Подобный диссонанс объясняется тем,

0 что в бтличие от обследованных людей в эксперименте, использовал и генетически идентичных, заведомо здоровых, содержащихся D одинаковых условиях лаборатор- ных животных что в реальной ситуации при

5 обследований людей практически исключе- |)0 I, V. r -

Формула изобретения

Способ определения стресс-реакций, включающий регистрацию уровня биологи0 чески актйв ных веществ (БАВ) в крови обследуемого; отличающийся тем, что, с целью псГв Ьниения точности способа, эритроциты доноров и обследуемого помещают в биологические жидкости обследуемого, в

5 которые првдва рительно.вносят меченые БАВ, регистрируют урбвень приращения связывания БАВ с эритроцитами обследуе-. мого, и при его значении менее 0,63 устанавливают наличие Vrpecc-реакции.

Л -

Т а .6 л,и ц а 1.

13178344014

Табли4«2

Ланние, полученные при обследовании рабочего П. по заявляемому спосооу

рации метки в среде производили по формуле

&2U-JB-- . XffiMKaSftM, XHOiiTftJt .-lKWf

где X приращение;

Y - связывание при концентрации метки в среде

инкубациир соответствующей точке перегиба

у интактного донора; Y - связывание метки при концентрации в среде

инкубации, в 10 раз большей

Т

Отношение приращений исследуемых показателей, полученных на этапе

и

Эритроциты здоровых

доноров, сыворотка

обследуемых

В пределах от 0,63

до 1,37

Менее 0,63

В пределах 063-1,37

Примечание: в том случае, когда отношение приращений связывания БАВ с эритроцитами здоровых доноров, инкубируемых в сыворотке обследуемого лица, менее 0,63, а отношение приращений связывания БАВ с эритроцитами обследуемого, инкубируемых в сыворотке здоровых доноров, более 1,37, состояние обследуемого следует оценивать как переход от стадии тревоги к стадии повреждения клеточных мембран. Пороги приращений 0,63 и 1,37 получены на основании статистического анализа по связыванию использован-, ных меченых лигандов у людей и лабораторных животных, заведомо находящихся в состоянии стресса или состояния покоя, и соответствуют р азмахам колебаний средней для кормы величины ± 38% (,05).

Эритроциты обследуемых, сыворотка здоро- вых доноров

В пределах 0,63-1,37 Более 1,37

Данные обследования 3 рабочих газоконденсатного завода,

имеющих III группу крови и резус +. Представлены данные

отношения приращений связывания БАВ к приращениям

связывания, полученным при выполнении 1 этапа (эритроциты

и сыворотка донора С).

Оценка стадии стресс-реакции по заявляемому способу и прототипу животных №17 и № 28

Таблица 4

Таблица 5