Способ диагностики инфаркта миокарда Советский патент 1987 года по МПК A61B10/00 C12N9/88 C12Q1/00 

Изобретение относится к медицинской эн- зимологии и может быть использовано для диагностики инфаркта миокарда.

Цель изобретения - повькиение точности способа за счет определения активности альдолазы типа А в сыворотке крови.

Способ осуществляется следующим образом.

В сыворотке крови кардиологических больных определяют активность альдолазы типа А и при ее уровне выще 8,1 Ед/л диагностируют инфаркт миокарда. Для определения активности альдолазы типа А разработан чувствительный способ, согласно которому пробу сыворотки крови инкубируют в присутствии эритрозо-4-фосфата (Э4-Ф) и i диоксиацетонфосфата (ДАФ) в концептра- ции 0,55-1,1 мМ, осаждают белок, к безбелковому супернатанту добавляют орцино- вый реагент, содержащий хлорное железо, образовавщийся окрашенный комплекс экст10

мещают в кипящую водяную баню на 80 мин, после чего ее быстро охлаждают под водопроводной водой до комнатной температуры. Прибавляют 0,1 мл 0,052%-ного раствора FeCta- 6Н2О на 4Н соляной кислоте и 0,1 мл 12%-ного спиртового раствора ор- цина (готовится перед употреблением). Пробу перемешивают и вновь помещают в кипящую водяную баню на 3 мин, охлаждают.

Экстракция хлороформом и определение оптической плотности. К пробе прибавляют 1,5 мл хлороформа, экстракцию окраски хлороформом проводят путем встряхивания образца ручным или механическим способом в течение 3-5 с. Содержимое пробирки переливают в обезжиренную, ополоснутую хлороформом спектрофотометрическую кювету на 3 мл с длиной оптического пути 10 мм.

Расслоение хлороформа и водной фазы происходит быстро. Окраска (синяя) разрагируют хлороформом, спектрофотометриру- 20 видается сразу, устойчива во времени Измерения проводят при длине волны 660 нм.

25

35

ют, по величине оптической плотности определяют количество гептулозы в пробе и активность альдолазы типа А, значение которой пропорционально приросту гептулозы за единицу времени.

Этот способ предусматривает проведение реакции Э4-Ф+ДАФ альдолаза. ,

типа А

лозо 1,7-дифосфат. Способ учитывает условия протекания ферментативной реакции в n ткани миокарда и сыворотке крови в норме и при инс|)аркте миокарда.

Пример 1. Определение активности альдолазы типа А в сыворотке крови практически здоровых людей. Получение сыворотки: у практически здоровых людей берут 5 мл крови из локтевой вены без добавления консервантов, центрифугируют дважды при 3000 д/мин в течение 20 мин. В исследовании используется 1,5 мл сыворотки (по 0,5 мл для двух параллельно исследуемых образцов, 0,5 мл - контроль). Сыворотка, используемая для анализа, должна быть лишена следов гемолиза, может храниться при +2, -|-4°С до 4-х суток или длительное время при -17°С (без размораживания) .

Проведение ферментативной реакции. Состав инкубационной пробы: 0,5 мл сыворотки крови, 0,55-1,1 мМ Э4-Ф 0,55- 1,1 мМ ДАФ 100 мМ триэтаноламин. НС1 буфера рН 7,6. Общий объем пробы 2,7 мл. Инкубацию проводят 60 мин при 37°С. Реакцию останавливают г.рибавлением 0,3 мл насыщенного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Центрифугирование при 3000- 5000д 20-30 мин.

Обработка ТХУ-фильтрата реактивом ор- цин-РеС з. В пробирку с притертой пробкой отбирают 2 мл ТХУ-фильтрата (критический объем пробы), добавляют 0,4 мл концентрированной соляной кислоты. Пробирку по40

45

50

55

В связи с небольшим объемом исследуемого образца для измерения коэффициента пропускания используют прилагаемую к спектрофотометру диафрагму. Кюветы в кю- ветодержателе поднимают с помощью подкладки (1X1 см), изготовленной из тефлона, резиновой пробки или другого материала. Состав и обработка контрольных проб так же за исключением того, что ТХУ добавляют раньше внесения сыворотки.

Приготовление стандартного раствора. 10 мг ангидрида гептулозы растворяют в 100 мл 5%-ной ТХУ. Для построения стандартной кривой используют образцы, содержащие 5,0-200 мкг ангидрида гептулозы, достаточно 3-4 образца. Этим методом можно определять как нефосфорилированную форму гептулозы, так и ее фосфорное производное. Стандартные образцы, холостую пробу на реактивы обрабатывают так же, как опытные и контрольные пробы. Доверительная чувствительность метода 0,05 мкмоль гептулозы в пробе. Полученные данные выражают графически, откладывая по оси абсцисс количество гептулозы (мкг) в пробе, а по оси ординат - величину оптической плотности, которая ему соответствует.

При построении стандартной кривой по ангидриду гептулозы не наблюдается отклонений от закона Бера.

Порядок расчета. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб, по калибровочному графику определяют содержание гептулозы в пробах. Высчитывают разницу в ее содержании между опытными и контрольными пробами (Д мкг).

Для выражения активности фермента в международных единицах Ед/л (мкмоль/лХ Хмин) используют формулу

Ед/л ДмкгХО,26, где 0,26 -коэффициент / пересчета.

0 видается сразу, устойчива во времени Измерения проводят при длине волны 660 нм.

5

5

n

40

45

50

55

В связи с небольшим объемом исследуемого образца для измерения коэффициента пропускания используют прилагаемую к спектрофотометру диафрагму. Кюветы в кю- ветодержателе поднимают с помощью подкладки (1X1 см), изготовленной из тефлона, резиновой пробки или другого материала. Состав и обработка контрольных проб так же за исключением того, что ТХУ добавляют раньше внесения сыворотки.

Приготовление стандартного раствора. 10 мг ангидрида гептулозы растворяют в 100 мл 5%-ной ТХУ. Для построения стандартной кривой используют образцы, содержащие 5,0-200 мкг ангидрида гептулозы, достаточно 3-4 образца. Этим методом можно определять как нефосфорилированную форму гептулозы, так и ее фосфорное производное. Стандартные образцы, холостую пробу на реактивы обрабатывают так же, как опытные и контрольные пробы. Доверительная чувствительность метода 0,05 мкмоль гептулозы в пробе. Полученные данные выражают графически, откладывая по оси абсцисс количество гептулозы (мкг) в пробе, а по оси ординат - величину оптической плотности, которая ему соответствует.

При построении стандартной кривой по ангидриду гептулозы не наблюдается отклонений от закона Бера.

Порядок расчета. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной проб, по калибровочному графику определяют содержание гептулозы в пробах. Высчитывают разницу в ее содержании между опытными и контрольными пробами (Д мкг).

Для выражения активности фермента в международных единицах Ед/л (мкмоль/лХ Хмин) используют формулу

Ед/л ДмкгХО,26, где 0,26 -коэффициент / пересчета.

Коэффициент пересчета получают следукх щим способом.

Полученные данные (разница между опытной и контрольной пробы) умножают на 2000 (для пересчета на 1 л сыворотки); умножают на коэффициент f, который зависит от количества отобранного ТХУ-фильтра- та из 3 мл общего объема пробы. При отборе из 3 мл общего объема пробы 2 мл

В табл. 1 представлены данные по определению активности альдолазы типа А в сыворотке крови практически здоровых людей при использовании различных концентраций субстратов.

Пример 2. Определение активности альдолазы типа А в сыворотке крови больного инфарктом миокарда.

Больной Д., 51 год, был доставлен в клинику с жалобами на жгучие боли за грудиной, удушье, выраженную слабость. Боли за грудиной возникли впервые в жизни в день госпитализации, длительность их пре- выщала 1 ч, эффекта от нитропрепаратов

ТХУ-фильтрата коэффициент f равен 1,5; затем делят на 60 (для выражения активности в 1 мин) и делят на 192 - молекулярный вес ангидрида гептулозы - моногидрата (для выражения активности в микромолях). Отсюда активность равна А мкгХО,26. Для нормальной сыворотки крови активность альдолазы типа А 6,02± ±0,5 ЕЯ/л.

Таблица -1

не отмечено. Боли купированы введением наркотических анальгетиков.

На ЭКГ при поступлении выявлялись признаки крупноочагового инфаркта миокарда нижнедиафрагмальной локализации. Уровень аспартаттрансаминазы 54 Ед (при

норме 45 Ед), креатинфосфокиназы 0,5 Ед (при норме 0,5 Ед). Активность альдолазы типа А (определяли как в примере 1) в 1, 2, 3, 4, 5 и 8 дни заболевания составила соответственно 24, 60, 48, 27, 30, 9 Ел/л. Величины активности отличались от аналогичного показателя у больных ишемической болезнью сердца, что позволило подтвердить диагноз острого инфаркта миокарда.

В табл. 2 представлены данные по определению активности альдолазы типа А в сыворотке крови больного инфарктом миокарда при использовании различных концентраций субстратов.

Для уменьшения погрешности в -измерении активности альдолазы типа А нри показаниях оптической плотности более 0,8, что бывает в случае крупноочагового инфаркта миокарда, используют 0,2 мл сыворотки крови (вместо 0,5 мл) или цельную сыворотку крови разводят 100 мМтриэтанол- амин- HCt буфером рН 7,6 в 2,5-5 раз, и определение активности повторяются.

Пример 3. Определение активности альдолазы типа А для диагностики инфаркта миокарда у больной без убедительных электрокардиографических данных.

Больная Р., 73 года, доставлена в стационар с жалобами на интенсивные «разрывающие боли в области сердца длительностью более 30 мин. В анамнезе - артериальная гипертония более 5 лет. На ЭКГ, снятой в блоке интенсивного наблюдения, убедительных данных за острый инфаркт миокарда не было.. Не отмечено также повышения уровня аснарагиновой и аланино- вой трансаминаз. Определение активности альдолазы типа А проводили в 1, 2, 3 и 4 дни заболевания, ее уровень составил соответственно 30, 45, 30, 36 Ед/л. По данным определения активности альдолазы типа А был подтвержден диагноз инфаркта миокарТ, аблица 2

0

да. На 11-й день на фоне острой сердечной недостаточности больная скончалась. При патологоанатомическом исследовании диагноз инфаркта миокарда был подтвержден. Таким образом, нри отсутствии электрокардиографических и других лабораторных показателей инфаркта миокарда определение активности альдолазы тина А позволило диагностировать инфаркт миокарда. Диагноз был верифицирован при патологоанатомическом исследовании.

Пример 4. Определение активности альдолазы типа А у больного при отсутствии признаков некроза в миокарде.

Больная 3., 54 года. Поступила в клинику с жалобами на боли за грудиной сжимающего, давящего характера, удушье. Длительность болей не превышала 15 мин,

5 боли купировались приемом нитроглицерина. На ЭКГ данных за острый инфаркт миокарда не было. Активность аспартаттранса- миназы в пределах нормальных показателей. Таким образом, на основании данных клиники, электрокардиографических показате0 лей диагноз острого инфаркта миокарда был исключен. Активность альдолазы типа А 6,5 Ед/л, что также указывало на отсутствие острого некроза в сердечной мыщце. У больной при -обследовании выявлен остео- хондроз шейно-грудного отдела позвоночника, что усугубляло болевой синдром в области сердца, но не оказывало влияния на активность альдолазы типа А. Опреде5

ление активности альдолазы типа А у данной больной позволило отказаться от диагноза острого инфаркта миокарда и расширило диапазон обследования больной. Результаты обследования позволили назначить адекватное лечение в связи с выявленным заболеванием.

Таблица 3

Практически здоров

Остеохондроз шейногрудного отдела

позвоночника

Стенокардия покоя

Стенокардия напряжения, функциональный класс:

I

II

III

Инфаркт миокарда, день заболевания:

В табл. 3 представлены усредненные данные по активности альдолазы типа А в сыворотке крови практически здоровых люДей и больных.

Составитель Н. Гуляева

Редактор И. ГорнаяТехред И. ВересКорректор .М. Самборская

Заказ 921/3Тираж 596Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

0

5

Таким образом, в течение 7 даей активность альдолазы типа А у больных инфарктом миокарда превышает уровень 8,1 Ед/л, максимальный для больных ише- мической болезнью сердца, стенокардией напряжения и покоя, что и позволяет использовать данный тест для диагностики некроза сердечной мышцы.

Преимущества предлагаемого способа диагностики инфаркта миокарда путем измерения активности альдолазы типа А заключаются в том, что при определении активности учитывают свойства фермента в миокарде и сыворотке крови. Это позволяет повысить диагностическую чувствительность способа.

Повышение химической чувствительности определения продукта реакции альдолазы типа А гептулозо-1,7-дифосфата в 3 раза особенно важно при необходимости установления дифференцированного диагноза между случаями с минимальными некротическими изменениями в миокарде и случаями без некроза миокарда. Все это позволяет использовать способ в условиях клиники для диагностики острого инфаркта миокарда и подтверждения диагноза инфаркта миокарда в случае наличия характерных изменений на электрокардиограмме, а также отдифференцировать инфаркт миокарда от хронических форм ишемической болезни сердца.

Формула изобретения

. Способ диагностики инфаркта миокарда путем определения активности фермента в сыворотке крови больного, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, в сыворотке определяют активность альдолазы типа А и при ее уровне выше 8,1 Ед/л диагностируют инфаркт миокарда.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения активности альдолазы типа А в сыворотке крови, пробу сыворотки инкубируют в присутствии эритрозо-4-фосфата и диокси- ацетонфосфата в концентрации 0,55- 1,1 мМ, осаждают белок, к безбелковому суперна- танту добавляют орциновый реагент, содержащий хлорное железо, образовавшийся окрашенный комплекс экстрагируют хлороформом, спектрофотометрируют, по величине оптической плотности определяют количество гептулозы в пробе и активность альдолазы типа А, значение которой пропорционально приросту гептулозы за единицу времени.

Изобретение относится к медицинской энзимологии, предназначено для диагностики инфаркта миокарда. Цель изобретения - повышение точности способа за счет определения активности альдолазы типа А в сыворотке крови. Для этого в сыворотке крови пациентов определяют активность альдолазы типа А инкубацией пробы в присутствии эритрозо-4-фосфата (Э4-Ф) и диокси- ацетонфосфата в концентрации 0,55-1,1 мМ. Затем осаждают белок, к безбелковому супер- натанту добавляют орциновый реагент, содержащий хлорное железо. Образовавшийся окрашенный комплекс экстрагируют хлороформом, спектрофотометрируют, по величине оптической плотности определяют количество гептулозы в пробе и активность альдолазы типа А, значение которой пропорционально приросту гептулозы за единицу времени. При уровне альдолазы типа А в пробе сыворотки крови выше 8,1 Ед/л диагностируют инфаркт миокарда. 1 з.п. ф-лы, 3 табл. i (Л со 00