Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/32 

113

Изобретение относится, к медицине, касается измерения ферментативной активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и может быть использовано при исследованиях влияния различных фак торов окружающей среды на организм человека и животных.

Целью изобретения является повышение точности за счет дополнительно очистки продукта реакции с помощью центрифугирования с последующим растворением полученного осадка в ацетоне .

Способ осуществляют следующим образом.

В пробирку с 1 мл дистиллированной воды вносят 0,2 мл крови и по 1 мл 0,15 М раствора фосфатной буферной смеси, 0,2 М раствора сукци- ната натрия и 0,1%-ного -раствора тетразолия. Пробы инкубируют при 37-38°С в течение 60-90 мин. Продукт реакции отделяют от инкубационной среды путем центрифугирования проб при 3000 мин в течение 15 мин, осадок промывают в 5-10 мл дистиллированной воды и центрифугированием в течение 5 мин при 3000 очищают от гемоглобина и других белковых структур крови, затем осадок раство ряют в 5 мл ацетона и центрифугируют при 3000 в течение 3-5 мин,,

Центрифугат, представляющий собой очищенный раствор формазана в ацетоне, фотометрируют, например, на спектрофотометре (AfTi 475 нм).

Активность фермента рассчитывают по формуле

.-

Dj

1

.,8Л„-----;--5 fj МОЛЬ/МЛ -мин,

ср

(1)

50

содержание формазана в стан- 45

дартной пробе, рг/мл; оптическая плотность стандартной и исследуемой проб при Яг„ 475 нм; пробы крови, мл время инкубации при

37-38°С, мин; молекулярный вес формазана,

(U г/ моль;

постоянный для предлагаемого способа коэффициент, учитывающий потери формазана при центрифугировании.

55

12

При измерении оптической плотности стандартных проб на спектрофотометре СФ-18 зависимость D от содержания формазана в стандартной пробе оказывается линейной в интервале значений от О до 100 .

При определении активности СДГ в тканях вместо смеси t мл дистиллированной воды с пробой крови используют 1 мл 5-10%-ного гомогената ткани. При этом операцию очистки продукта реакции от гемоглобина и белковых структур можно не производить, поскольку в спектре поглощения раствора гомогената ткани спектр Сорета отсутствует. Расчет активности фермента производят по формуле (1), в которой величину объема крови V заменяют на вес (массу) ткани в 1 мл раствора гомогената в rpaMi iax. Величину активности в этом случае выражают в/J моль/ /г мин.

В таблице показано сравнение результатов определения активности СДГ по предлагаемому способу и способу Куна-Эбуда (известному), Анализ проводили в пробах ткани печени крыс.

30

Вследствие высокой оптической плотности перед фотометриро- ванием пробы разбавляли ацетоном в соотношении 1:4 (1 мл пробы -f 4 М.П ацетона) ,

Форму-Л а изобретения

Способ определения активности сукцинатдегидрогеназы в биологических объектах, включающий их инкубацию с субстратом в присутствии тетразоля в буферной среде с последующим центрифугированием и фотометрическим

313018414

измерением продукта реакции, о т- та реакции центрифугированием в личающийся тем, что, с це- течение 10-15 мин при 3000 об/мин с лью повышения точности способа, про- последующим растворением полученного водят дополнительную очистку продук- осадка в ацетоне.

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повьшение точности способа. В пробирку с дистиллированной водой вносят кровь, фосфатную буферную смесь, раствор сукцината натрия и раствор тетразолия. Пробы инкубируют и центрифугируют. Осадок очищают от белковых структур крови, растворяют в ацетоне и центрифугируют. Центрифугат фотометрируют и рассчитывают активность фермента. 1 табл. ш ас