Способ определения катехоламинов в биологическом материале Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

ю

113021942

лоты (5 мл), затем центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, Супернатант сливают, осадок вновь центрифугируют, перемешивают с новой порцией кислоты (5 мл) и подвергают обработке с помо- щью ультразвукового дезинтегратора (150 Вт, амплитуда 10 мк) в течение 2 мин. После повторного центрифугирования (15 мин при 4000 об/мин) супер- натант переносят к первой порции кислоты. Объединенную смесь кислот смешивают с окисью алюминия (0,5 г) при 4 С и перемешивают в течение 30 мин стеклянной лопаткой или миксером при 100 об/мин. Окись алюминия с кислотой количественно переносят на бумажный фильтр Шотта. С помощью вакуумного отсоса кислоту удаляют, а окись

центрифугируют 20 промывают дистиллированной водой (1015 мл). Высушенный под вакуумом порошок окиси алюминия вместе с бумажным фильтром переносят в пробирку с гек- саметилдисилазаном (1,5 мл) и 15 мг

Изобретение относится к исследованию химических и физических свойств биологических веществ и может быть использовано в экспериментальных и клинических исследованиях для обнару- 5 жения и количественного определения биологически активных соединений - адреналина, норадреналина и дофамина,

Целью изобретения является ускорение и повышение точности анализа за счет снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску ткани 100-250 мг перетирают на холоду (4°С) в стеклянном гомогенизаторе в растворе 0,1 н. хлорной кислоты объёмом 5 мл (4000 об/мин, 5 мин). Супернатант сливают, осадок вновь гомогенизируют, перемещивают с новой порцией 0,1 н. хлорной кислоты (5 мл) и подвер15

гают обработке с помощью ультразвуко- 25 Ульфата аммония (катализатор), за- вого дезинтегратора (150 Вт, амплитуда 10 мкм) в течение 2 мин. После повторного центрифугирования (4000 об/мин, 15 мин) супернатанты объединяют, смешивают с окисью алюми- зо жидкость упаривают до 50 мкл при ния (0,5 г) в стеклянном стакане (на . 165°С и проводят хроматографический

тем кипятят с обратным холодильником при 145°С в течение 25 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 145°С. Полученную

20 мл) при 4°С и перемешивают в течение 30 мин. Смесь переносят на бумажный фильтр, помещенный на стеклянном фильтре Шотта, с помощью вакуумного отсоса кислоту удаляют, осадок промывают дистиллированной водой (10- 15 мл), высушивают под вакуумом, вносят вместе с бумажным фильтром в пробирку с гексаметилдисилазаном (1,5 мл) таким образом, чтобы уровень гексаме- тилдисилазана бьт выше уровня окиси алюминия, добавляют сульфат аммония (10-20 мг), кипятят 15-30 мин с обратным холодильником при 130-160°С, реакхдаонную смесь перегоняют под вакуумом при 140т150 С и упаривают при 160-170° до 50 мкл, после чего проводят газовую хроматографию с иони- зационно-пламенным детектором на трехметровой стеклянной колонке с внутренним диаметром 3 мм, заполненной хроматоном (0,125-0,160 мм)+ 5% Е-30 при температуре испарителя 230 С и термостата колонок 210°С.

Пример 1. Навеску надпочечников собаки 50 мг перетирают на холоду () в стеклянном гомогенизаторе в растворе 0,1 н. хлорной кис35

40

45

50

55

анализ в стандартных условиях.

П р и м е р 2, Навеску надпочечников собаки в количестве 150«мг перетирают при 4°С в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл Ojl н. раствора хлорной кислоты и проводят операции как в примере 1 До этапа кипячения гекса- метилдисилазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.

Смесь кипятят с обратным холодильником при 130 С 15 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 140 С. Полученную жидкость упаривают при 160 С до 50 мкл и проводят газохроматографический анализ в стандартных условиях.

П р и м е р 3. Навеску надпочечников собаки в количестве 150 мг перетирают на холоду (4°С) в стеклянном гомогенизаторе в 5 m раствора (0; н.) хлорной кислоты и проводят операции, как в примере 1 до зтапа кипячения гексаметилдисипазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.

Ульфата аммония (катализатор), за- жидкость упаривают до 50 мкл при 165°С и проводят хроматографический

тем кипятят с обратным холодильником при 145°С в течение 25 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 145°С. Полученную

5

0

5

0

5

анализ в стандартных условиях.

П р и м е р 2, Навеску надпочечников собаки в количестве 150«мг перетирают при 4°С в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл Ojl н. раствора хлорной кислоты и проводят операции как в примере 1 До этапа кипячения гекса- метилдисилазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.

Смесь кипятят с обратным холодильником при 130 С 15 мин. По истечении этого времени проводят вакуумную перегонку при 140 С. Полученную жидкость упаривают при 160 С до 50 мкл и проводят газохроматографический анализ в стандартных условиях.

П р и м е р 3. Навеску надпочечников собаки в количестве 150 мг перетирают на холоду (4°С) в стеклянном гомогенизаторе в 5 m раствора (0; н.) хлорной кислоты и проводят операции, как в примере 1 до зтапа кипячения гексаметилдисипазана с катехоламинами, сорбированными на окиси алюминия. Затем условия меняют следующим образом.

313021

Смесь кипятят с обратным холодильником при 30 мин, проводят вакуумную перегонку при . Полученную жидкость упаривают при 170°С до 50 мкл и проводят газохроматографи- 5 ческий анализ в стандартных условиях.

Ошибка способа не превьшает 3%.

Формула изобретения

Способ определения катехоламинов в биологическом материале путем гомогенизации исследуемой пробы в хлорной кислоте, центрифугирования сорбции катехоламинов супернатанта на окиси алюминия, упаривания и получения силиловых эфиров катехоламинов при обработке гексаметилдисилазаном с последующей газовой хроматографией, отличающийся тем, что с целью ускорения и повьшемия точности

Составитель Н.Гуляева Редактор О. Юрковецкая Техред И.Попович

Заказ 1212/44 Тираж 777 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий I13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,, г. Ужгород, ул. Проектная, 4.

5

0

5

944

анализа за счет снижения потерь катехоламинов в процессе обработки биологического материала, перед нанесением супернатанта на окись алюминия проводят ультразвуковую дезинтеграцию осадка в хлорной кислоте, повторно центрифугируют, супернатанты после первого и второго центрифугирования объединяют, смешивают с окисью алюминия, которую затем высушивают под вакуумом на бумажном фильтре, помещенном на стеклянном фильтре Шотта, и вносят вместе с бумажным фильтром в прб бирку с гексаметилдисилазаном таким образом, чтобы уровень гексаме- тилдисилазана был вьппе уровня окиси алюминия, добавляют сульфат аммония, выдерживают при 130-160°С в течение 15-30 мин, затем реакционную смесь перегоняют под вакуумом при 140- 150 С и упаривают при 160-170 С, после чего проводят газовую хроматографию.

Корректор Л.Патай

Изобретение предназначено для исследования физических и химических свойств биологических веществ и для экспериментальных и клинических ис- . следований обнаружения и количественного определения биологически активных соединений - адреналина, норадре-- налина и дофамина. Цель изобретения- ускорение и повьппение точности анализа путем снижения потерь катехола- минов в процессе обработки биологического материала. Для этого навеску ткани (100-250 мг) перетирают на холоду () в стеклянном гомогенизаторе в растворе О,1 н. хлорной кислоты, центрифугируют (4000g, 15 мин). Су- пернатант сливают, осадок вновь гомогенизируют, перемешивают с такой же