Ферментативный способ определения концентрации антибиотика с бета-лактамным кольцом Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/04 C12N9/52 C12N9/52 C12R1/03 

113

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано для определения присутствия антибиотиков в биологических жидкостях и его концентрации в процессах ферментации,

Целью изобретения является повышение чувствительности способа за ичет использования иммобилизованного фермента.

Пример I. Определение концентрации пенициллина G в молоке„

Используемую в качестве подложки смолу пoли-(N,N-димeтилaкpилaмид) получают путем сополимеризации, осуществляемой в эмупьсии, смеси 12 г Ы,К-диметилакриламида, 1 г Н,Н-эти- ленбисакриламида и 1,4 г сложного метилового эфира N-акрилоилсаркозина Получают 12-13 г смолы, имеющей вид жемчуга, гранулометрический состав которого равен 0,1-2 мм.

10 г смолы вводят в 320 мл этилен- диамина, полученную смесь перемешивают в Течение ночи при температуре окружающей среды. Затем смолу отфильтровывают и последовательно промывают ее в Ы,Н-диметилформамиде и воде до установления .нейтральной величины рН.

Далее смолу промывают в метаноле и оставляют для устранения набухания в присутствии простого диэтилового эфира.

Получают 10 г смолы, содержащей 0,3 моль этилендиамина на 1 г.

6,7 г глутаровой кислоты и 12,7 г N-оксисукцинимида растворяют в 50 мл Н,Ы-диметилацетамида при О С. Затем в полученный раствор вводят по каплям раствор дициклогексилкарбодиимида (23,7 г) в дихлорметане (50 мл); Смесь оставляют до уравнивания температуры раствора с температурой окружающей среды, а затем после выдержки в течение ночи осуществляют фильтрование реакционной смеси и выпаривание фильтрата. Остаток кристаллизуют в простом диэтиловом эфире,, Получают сложный диэфир Ы оксисукцинимида глутаровой кислоты при квазиколичественном выходе.

500 мг смолы поли-(Н51 1-диметил- акриламид), содержащей функциональные группы, полученные от этилендиамина (этап q ),, суспендируют в 50 r-yi Н,Ы-диметилацетамида. Затем в смесь вводят 2 г сложного диэфира N-OXCM- сукцинимида глутаровой кислоты (этап S). Полученную смесь перемеши32

вают в течение 24 ч при температуре окружающей среды. Смолу отфильтровывают и пятикратно про мывают в 100 мл N5N-димeтилaцeтaмкдa, а затем в 100 мл

метанола, смолу оставляют для устранения набухания в присутствии простого диэтилового эфира.

600 мг очищенного фермента R 39 с удельной активностью 19,8 ед./мг

протеина (1 ед. фермента R 39 катализирует гидролиз 1 ммоль N-альфа, Ы-эпсилон-диацетил-Ь-лизил-В-аланил- -D-аланина в 1 м при З7 с при инкубации фермента с раствором 8 мМ субстрата в буферном растворе трис-НС1 0,03 М (рН 7,5), содержащем 3 мМ MgClj), растворяют в 1 мл буферного раствора трис-НС1 О., 1 М (рН /,7), содержащем NaCl 0,2 М и MgClj 0,05 М, и подвергают диализу в течение 6 ч против 200 мл буферного раствора Не- pes 0,1 М (рН 7,7), содержащего NaCl 0,1 М и MgCl,, 0,05 М. Диализ повто

ряют 4 раза.

100 мг г1оли(К,Ы-диметилакриламид- ной) смолы, полученной по этапу 6, оставляют набухать в 50 мп К,Н-ди метилацета -й€да. Пт; ;- мерно через 3 ч частицы достнг-ашт точки максимального набухания, и-юлу отфильтровывают и пятикратно щломы.зают в 100 мл буферного раствора К грез 0,1 М(рН7,7), а затем повторяют промывку в 100 мл буферного раствора Hepes О,1 М

(рН 7,7)5 содержащем NaCl О,1 М и KgClj 0,05 М.

Полученную влажную смолу помещают в колбу объемом 10 MJ, прибавляют 70 мкг фермента R 39, растворенного в 1,75 мл раствора Hepes 0,1 М, содержащего 0,1 М NaCl и 0,05 М MgCl.. Затем колбу вращают со скоростью 100 об, в течение 16 ч при температуре окрузхающе. й среды.

Смолу отфильтровывают, пятикратно промывают в 10 мл буферного раствора Hepes 0,1 М (pEf 7,7), содержащем 0,1 М NaCl и 0,05 М MgCl. Затем смолу выдер.хивают под вакуумом Б течение 30 мин.

Получают 503 мг смолы Ферментативная активность фермента R 39, иммобилизованного ча смоле,, соответствует 15 мкг. Выход или производита,аьность иммобилизации составляет 21%«

Готовят раствор субстрата содер 6 мг N-альфа, Ы-э(1СН.;7он--диаце тил-Ь-лизин-0-ал нкл-С-ал :.нкна или

К-альфа-ацетил-Ь-лизил-В-аланил-В- аланина в 1 мл воды.

Готовят суспензию, содержащую 5 мг D-аминокислоты-оксидазы (специфическая активность 15 ед,/мг) в 1 мл вод- кого трехмольного раствора сульфата аммония.

Готовят раствор флавийа-аденина- динуклеотида (ФАД), содержащий 500 мкг ФАД в 6 мл буферного раствора трис- НС1 0,1 М (рН 8,0)

Приготавливают раствор, содержащий 50 мкг пероксидазы в 1 мл воды, и раствор, содержащий 2,6 мг дихлор- гидрата о-дианизидина в 500 мкл воды

Определение проводят следующим образом.

Готовят серию образцов по 1 мл молока, в которых содержится известная концентрация пенициллина G, а также два образца (белый и сравнительный) без .пенициллина G. К каждому образцу прибавляют мг иммобилизованного фермента ft 39 и инкубируют смеси в течение 20 мин при 37°С. После инку- бации молоко отделяют от фиксированного фермента, промывают последний трехкратно в 1 мл буфера Hepes О,1 М (рН 7,7), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05 М MgCl. Затем к ферменту до- бавляют 20 мкл буфера Hepes 0,1 М (рН 7,7), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05 М MgClj и 10 мкл раствора субстрата (дпя сравнительного образца и образцов, содержащих пенициллин G) или 20 мкл буферного раствора Hepes и 10 мкл воды (для белого образца). Инкубируют смеси в течение 30 мин при 37 С. В процессе инкубации прибавляют в полученную смесь 2 мкл сус пензии. D-аминокислоты-оксидазы, 60 мкл раствора ФАД. 1.0 мкл раствора пероксидазы и 5 мкл раствора о-дианизидина. Затем смеси дополнительно инкубируют в течение 10 мин при 37 С

На спектрофотометре измеряют опти ческую плотность полученных окрашенных растворов. Дп я этого вводят. 1 мл раствора метанол - вода (1:1) в кювету и измеряют оптическую плотность при 460 нм.

Вьрштают значение оптической плотности, найденное для белого образца, из значений, полученнь х для сравни- тельного образца и всех других образцов. Затем вычисляют процентное вьфа жение остаточной ферментативной активности для каждого образца, исходя

из значений оптической плотности, полученных ранее.

Результаты определения концентрации пенициллина G в молоке двух серий образцов приведены в табл.1

Полученные результаты воспроизводят в виде графика, по оси которого откладывают концентрации пенициллина в ед.акт./мл, а по оси ординат - процентное.вьфажение остаточной ферментативной активности« Этот график служит эталоном в последующих определениях концентрации антибиотика в молоке.

Данным способом определяют концентрацию антибиотика порядка 0,0005 ед, акт./мл молока (известным способом - 0,01 - 0,001 ед.акт./мл исследуемой жидкости).

Пример 2. Определяют концентрацию пенициллина G в сыворотке или моче. Опыт проводят аналогично примеру 1, используя 1 мл сыворотки или мочи.

Результаты определения концентрации пенициллина G в сыворотке представлены в табл.2.

Результаты определения концентрации пенициллина G в моче представлены в табл.3.

При использовании сыворотки и Мочи способ позволяет определять концентрацию пенициллина G 0,003 ед.акт,/мл.

Известный способ не позволяет определять пенициллин в моче.

П р и М е р 3. Опыт проводят аналогично примерам 1 и 2, но в сыворотке определяют концентрацию цефалоспо- рина С.

Результаты определения концентрации цефалоспорина С в сыворотке приведены в табл.4.

Пример 4. Определение концентрации цефалоспорина С в сыворотке при высокой температуре.

Опыт осуществляют в условиях, аналогичных примеру 3, но инкубацию осуществляют при температуре.47 G, время инкубации сокращают вдвое. К каждому образцу сыворотки объемом 1 мл прибавляют предварительно 100 мкл буферного раствора Hepes 0,5 М (рН 7,7), содержащего NaCl 0,5 М и MgCl 0525М. Результаты определения приведены в табл.5.

Из данных опыта следует, что способ можно осуществлять при повышенной

5

температуре, ускоряя время проведения определения.

Формула изобретения

Ферментативный способ определения концентрации антибиотика с бета-лак- тамным кольцом в биологической жидкости, путем инкубирования исследуемой пробы с В-аланил-В-аланин-карбо- ксипептйдаЗой, продуцируемой Actino- madura R 39, с последующим инкубированием полученного комплекса антибиотика с ферментом с раствором субстрата N-альфа, N-эпсилон-диацетил- -Ь-лизил-В-аланил-В-аланина или N- альфа-ацетил-Ь-лизил-В-апанил-В-ала13353 5

нина, с последующим определением количества образовавшегося В-аланина, по концентрации которого определяют остаточную ферментативную активность,

5 и определением количества антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа,

JO инкубирование пробы осуществляют с ферментом, иммобилизованным ковалент- но на поли-(Н,К-диметилакриламидной) смоле сетчатой структуры, перед инкубированием с.раствором субстрата

15 комплекс антибиотика с ферментом отделяют и промывают буферным раствором с рН 7j7

Таблица 1

Зветло-желтый

Жепто-коричневый Коричневый 11

GB етло-желтый

Светло-желтьм

Жел тый

Желто-коричневый

100Коричневый

С.В е тл о-жел ThiH

Таблица2

ТаблицаЗ

ТаблицаА

О.Светло-желтый

8 44Желто-коричневый

100Коричневый

-Светло-желтый

10 2 1

О О

0,040 0,035 0,095

О, 180 0,035

Составитель Г.Смирнова Редактор Н.Лазаренко . Техред М.Ходанич Корректор Е.Рошко

Заказ 1984/59Тираж 500Подписное

ВНИИГШ Государственного кo raтeтa СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

ТаблицаЬ

О

О

41

Светло-желтый

Желто-коричневый

100 Коричневый

- Светло-желтый

Изобретение относится к медицине и может быть применено при определении присутствия антибиотиков в биологических жидкостях и его концентрации в процессах ферментации. Цель изобретения - повышение чувствительности способа путем использования фермента, иммобилизованного ковале нт- но на пoли-(N,N-димeтилaкpиднoй) смоле сетчатой структуры. Для этого исследуемую пробу инкубируют с D-ала- нил-В-аланин-карбоксипептидазой, продуцируемой Actinomadura R 39. Затем инкубируют полученный комплекс антибиотика и фермента с раствором субстрата N-альфа, N-эпcилoн-диaцeтил-L- -лизил-В-аланил-В-аланина или N-аль- фа-ацетил-Ь-лизил-В-аланил-В-аланина. Далее определяют концентрацию образовавшегося В-аланина, а по ней - остаточную ферментативную активность. Определяют количество антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем. 5 табл. G со со со сл со сн