Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей фермент деацетоксицефалоспорин С синтетазу/деацетилцефалоспорин С синтетазу Советский патент 1992 года по МПК C12N15/52 

Изобретение относится к генетической инженерии, касается получения плазмидных ДНК, кодирующих фермент -с активностью деацетоксицефалоспорин С синтетазы (DAOSC) и деацетилцефало- спорин С синтетазы (DACS)„

DAOCS катализирует реакцию, в которой из пенициллина N образуется (DAOS), и является экспандазой,- UACS катализирует образование деацетилце- фалоспорина (DAS) и DACS по реакции гидроксилирования. Эти реакции являются основными этапами биосинтеза важных антибиотиков, таких как цефа- лоспорины из Cephalosporium acremo- ,niuffl и 7 ot-метоксицефалоспорины из Streptomyces clavuligerus.

Фрагмент ДНК, кодирующий активность DACS/DAOCS, ввделяют из геномной ДНК Cephalosporium acremonium и

используют для построения векторов экспрессии, которыми трансформируют штаммы Escherichia coli.

Сырые клеточные экстракты из трансформированных E.coli проявляют активность DAOCS/DACS без какой-либо предварительной активации. Сконструированные векторы и трансформанты обеспечивают эффективное получение больших количеств активного фермента DAOCS/DACS. Фермент DAOCS/DACS можно применять для продуцирования DAOCS и DACS и для гидроксилирования цефалоспоринов для образования новых антибиотиков.

Рекомбинантные плазмидные ДНК могут быть использованы для создания штаммов Penicillium, fCephalosporium, продуцирующих пенициллиновыё и цефа- tлоспориновые антибиотики.

«

Ё

XI

СО

ч

00

ел

Оч

GJ

В предлагаемом описан усовершенст вованный способ трансформации Peni- cillium рекомбинантными ДНК. Эта нова система трансформации использует amds ген Aspergillus nidulans. Используя ацетамид (CHjCONH2), как единственный источник углерода или азота на пластинах трансформации, можно отобрать клетки хозяина Penicillium, трансформированные вектором, содержащим ген amds, от нетрансформированных, которые не в состоянии расти на данных пластинах ввиду того, что клетки хозяина PeniciIlium дикого типа не выражают -активность ацетамидазы

Предлагаемые рекомбинантные плаз- мидные ДНК могут быть использованы для получения штаммов Paecilomyces и Streptomyces, в частности S.clavuli- gerus, которые экспрессируют DAOCS/ /DACS. Хотя ДНК, кодирующую DACS/ /DAOCS, выделяют из Cephalosporium acremoniura, плазмидная ДНК, содержащая этот ген, может быть использована для построения векторов экспрессии DACS/DAOCS в широкой разновидности клеток хозяев. Большинство организмов которые продуцируют пенициллины и це- фалоспорины, используют .общий пред шествующий пенициллин N, субстрат для DAOCS. Фрагменты ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, могут использоваться в

способах построения векторов экспрессии при трансформации широкой разновидности организмов, продуцирующих пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики .

ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, выделяют с регуляторными последовательностями, которые контролируют транскрипцию. Описаны новые регуляторн ые последовательности, которые могут использоваться в новых способах для обеспечения трансляции и транскрипции любого генного продукта в Cephalospo- rium Эти регуляторные последовательности особенно эффективны в C.acremo- nium.

Описаны регуляторные сигналы гена DACS/DAOCS, расположенные у 3 -конца кодирующего гена DACS/DAOCS Cephalosporium acremonium. Эти 3 -регуляторные последовательности кодируют термина- цию транскрипции и полиапенилирование РНК, а также сигналы обработки гена DACS/DAOCS. Помещение этих сигналов в 3 -конце гена усиливает экспрессию гена в Cephalosporiumо

5

5

Последовательность ДНК штамма Brotzu Cephalosporium acremonium, кодирующая как активность DACS, так и активность DAOCS, представлена в виде:

Изобретение касается получения плазмид, кодирующих фермент с активностью деаДектосицефалоспорин С син- тетазы и деацетилцефалоспориа.С син- тетазы. Сконструированы рекомбинант- ные плазмидные ДНК , рТТ507, pLT511, pPS58, pPS359, pPSbO, pPS61, pPS62, pIL502, обеспечивающие экспрессию DAOCS/DACS в клетках Escherichia co- li, Penicillium chrysogenum и Cepha- losporum acremonium.

Ю20 30 40

. 5 -A AGC TTG TAG GGA GAA ТТА AGG CTT GCA CGA TTC CAT GGC GGT СТС

50 60 7080 90

GAC GAT GAG GGA CCA TGC ACG ATA CAT ATT CTC CTG CGA ACC AAG AAC

„А„ 10° no 120 . 130 GAG AAG AGA ACT CGA TGG CTT CTT ATG ATT CGT TGA CAA AAC TTC АСА

160 170 iftn ion AGA CAC TCG TGG GTT TAG AAT GCT АСА TTG ACG TGT GCG GCC AAG GCT

200 210 220 9чп GAG™ МО САСИС GIC ACT TAC OGC IAA GIA GCA GIT TAA AAA

GCA GIT CCT COG CGT AAG СТА CGA GGT GOG ОЙ°ТОА GAT ATA

CCO с тЦСА САА СсГтТС GIT СтЛсТ «CO АТС % IOA AIC ™ш С CTC TTO CAG AAC ITT CCT CCA CGC°TAC TCC TcfL GIC «Jg

CAA AAC AIC ACT ICC MO GTC CCC GTc V COT

№T THR SER tYS VAl PRO S Ј5 Ш SS

517398566

5 10

440 450 460 470

GAC GAC CTC AAG AGO GGC AAG GTC CTC ACC GAG CTC GCC GAG GCC GTC ASP ASP LEU LYS SER GLY LYS VAL LEU THR GLU LEU ALA GLU ALA VAL

152025

480 490 500 510 520 ACC ACC AAG GGT АТС TTC TAC TTG ACC GAG AGC GGC CTG GTC GAC GAC THR THR LYS GLY ILE PHE TYR LEU THR GLU SEЈ GLY LEU VAL ASP ASP 303540

530 540 550 560 570 GAC CAC ACC TCG GCG CGT GAG ACG TGC GTT GAC TTT TTC AAG AAC GGA ASP HIS THR SER ALA ARC GLU THR CYS VAL ASP PHE PHE LYS ASN GLY

455055

580 590 600 610 620 AGC GAG GAG GAG AAG AGG GCC GTG ACG CTC GCC GAC CGT AAC GCC CGC SER GLU GLU GLU LYS ARC ALA,VAL THR LEU ALA-ASP ARC ASN ALA ARC

606570

630 640 650 660 670 CGC GGC TTC TCT GCC CTC GAG TGG GAG AGC ACC GCC GTC GTC ACC GAG ARG GLY PHE SER ALA LEU GLU TRP GLU SER THR ALA VAL VAL THR GLU 75808590

680 690 700 710

ACG GGC AAG TAC TCG GAC TAC TCG ACG TGC TAC TCC ATG GGC АТС GGC THR GLY LYS TYR SER ASP TYR SER THR CYS TYR SER MET GLY ILE GLY 95100105

720 730 740 750 760 GGC AAC CTG TTC CCG AAC CGG GGC TTC GAG GAC GTC TGG CAG GAC TAC GLY ASN LEU PHE PRO ASN ARG GLY PHE GLU ASP VAL TRP GLN ASP TYR

110115120

770 780 790 800 810 TTC GAC CGC ATG TAC GGC GCA GCC AAG GAT GTC GCG CGC GCC GTT CTC PHE ASP ARG MET TYR GLY ALA ALA LYS ASP VAL ALA ARG ALA VAL LEU 125130135

820 830 840 850 860 AAC TCT GTG GGC GCC CCG CTC GCC GGG GAG GAC ATT GAT GAC TTC GTC ASN SER VAL GLY ALA PRO LEU ALA GLY GLU ASP ILE ASP ASP PHE VAL 140145150

870 880 890 900 910 GAC TGC GAT CCC CTC CTC CGC СТА CGG TAC TTC CCC GAA GTG CCG GAG GLU CYS ASP PRO LEU LEU ARG LEU ARG TYR PHE PRO GLU VAL PRO GLU 155160165170

920 930 940 950

GAC CGC GTC GCC GAA GAG GAA CCC CTC CGC ATG GGA CCC CAC TAC GAC ASP ARG VAL ALA GLU GLU GLU PRO LEU ARG MET GLY PRO HIS TYR ASP

175180185

960 970 980 990 1000 СТА TCG ACC АТС ACG CTC GTG CAC CAG АСА GCC TGC GCC AAC GGC TTC LEU SER THR ILE THR LEU VAL HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY PHE 190195200

-7 7398568

1010 1020 1030 1040 1050

GTG AGC CTG CAG TGC GAG GTG GAG GGA GAATTC GTC GAC CTC CCG ACG

VAL SER LEU GLN CYS GLU VAL ASP GLY GLUPHE VAL ASP LEU PRO THR

205210215

1060 1070 1080 1090 1100

CTC CCC GGC GCC ATG GTC GTC TTC TGC GGCGCG GTC GGC ACC CTG GCC LEU PRO GLY ALA MET VAL VAL PHE CYS GLY ALA VAL GLY THR LEU ALA 220 225230

1110 1120 1130 1140115C

ACG GGC GGC AAG GTC.AAG GCG CCC AAG CAC CGG GTC AAG TCT CCCGGG

THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA PRO LYS HIS ARG VAL LYS SER PROGLY

235 240 245250

CGC GAC CAG CGC GTC GGC AGC AGC CGC ACG TCG AGC GTC TTC TTCCTG

ARG ASP GLN ARG VAL GLY SER SER ARG THR SER SER VAL PHE PHELEU 255 260 265

1200 1210 1220 1230 1240

CGG CCG AAG CCC GAC TTCAGC TTC AAC GTG CAG CAG TCG AGO GAG TGG

ARG PRO LYS PRO ASP PHESER PHE ASN VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP

270275280

1250 1260 1270 - 1280 1290

GGT TTC AAC GTC CGC АТСCCG TCG GAG CGC ACG ACG TTC AGG GAG TGG

JLY PHE ASN VAL ARG ILEPRO SER GLU ARG THR THR PHE ARG GLU TRP 285290295

1300 1310 1320 1330 1340

CTT GGC GGG AACTAT GTC AAC ATG CGG AGG GAT AAG CCG GCG GCA GCG

LEU GLY GLY ASNTYR VAL ASN MET ARG ARG ASP LYS PRO ALA. ALA ALA 300305310

1350 1360 1370 1380 1390

GAG GCG GCT GTCCCC GCG GCT GCC CCT GTC TCT ACC GCA GCT CCT ATA

GLU ALA ALA VALPRO ALA ALA ALA PRO VAL SER THR ALA ALA PRO ILE 315320325330

1400 1410 1420 1430

GCC ACT TAG GGA ACC CGC CGA TCG ACT AAT AAA TCT ACG GGA GTT TAA ALA THR

1440 1450 1460 1470 1480 GAA GAA AAA TTG CCC TAT AAA TTG СТА ДАТ ТТТ TAA AAC АСА AAG CAT

1490 1500 1510 .. GAG TGT CAA GAG TTT CAA GTT TCA A-3

Фрагменты ДНК, кодирующие фермент с активностью DACS/DAOCS, выделяют из штамма Cephalosporium acremonium, известного как штамм Brotzu, который содержится в коллекции культур американского типа, Роквилл, Мэрилэнд (хранится под номером АТСС 11550). Геномную библиотеку ДНК штамма Brotzu строят в бифункциональном космидном векторе рКС462А (существующим в Е.со- li K12 под номером NRRLB-15973) и исследуют на наличие последовательностей, гомологичных ряду 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов. Этот ряд деоксирибоолигонуклеотидов был построен на основании информации о частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonium DACS/ /DAOCS и знании генетического кода. Были отобраны клоны, гомологичные одному или нескольким из 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов.

Идентифицируют плазмидные ДНК, кодирующие фермент DACS/DAOCS, из которых выделяют фрагмент л/7 кВ Bam HI, включающий ген DACS/DAOCS, и встраивают его в коммерчески доступную плазмиду риС8. Получают плазмиду , которой трансформируют E.coli Kt2 JA 221. Трансформанты E.coli K12 JA 221/pIT508 депонируют в коллекции культуры Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (NRRu), Пеория, IL 61604, под номером NRR LB-18170.

Плазмида р1Т503 служит в качестве исходного материала для построения ругих векторов экспрессии. Эти вектоы, пригодны для получения фер.мента DACS/DAOCS в рекомбинантной клетке хозяина. Для этого осуществляют трансформацию клеток хозяина рекомбинантной плазмидной ДНК, которая включает: промотор и последовательность, активирующую процесс трансляции; последовательность ДНК, которая кодирует DACS/ /DAOCS и операбельно связана с ука- занным промотором; культивирование трансформированной клетки-реципиента, трансформированной в условиях, обеспечивающих синтез фермента.

Плазмиду выделяют из E.coli К12 JA 221, используют для построения векторов экспрессии DACS/DAOCS. Плазмида используется в качестве исходного материала для построения плазмиды , которая обеспечивает высокую степень

0

0

5

экспрессии фермента DACS/DAOCS в E.coli.

Построение плазмиды включает сшивку Sst I - Bam HI фрагмента размером 2,2 кв, кодирующего DACS/ /DAOCS плазмиды с 5,8 кв Nde I - Ban HI фрагментом плазмиды pCZR336, и синтезированным фрагмен- п.о. Sst I - Nde I.

Плазмида pCZR336 включает образованный от ДрЬ промотор, последовательность, активирующую трансляцию, оператор гена , первую функциональную единицу наследственности

5 (Цистрон), кодирующую небольшой

пептид, и последовательность ДНК, кодирующую производное hGH0 При низкой температуре, составляющей 30 С,.белок, копированный на плазмидах pCZR33C и , является активным и способен подавлять активность промотора ДрЬ, но при повышении температуры до1 42°С белок инактиви- руется и промотор ускоряет транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей hGH (pCZR336) или DACS/DAOCS (pIT507).

I Плазмида включает тот же -|лервый цистрон, ген, промотор

О и последовательность, активирующую трансляцию, что и плазмида pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена DACS/DOACS от плазмиды вместо кодирующей

5 последовательности hGH. Ограничительный фрагмент 2,2 п.о. Sst I - Бага HI плазмиды включает большую часть кодирующей последовательности DACS/DAOCS, остальная часть этой ко0 дирующей последовательности содержится в синтезированном фрагменте 60 п.о. Nde I - Sst I с небольшой модификацией по сравнению с последовательностью ДНК дикого типа, что об5(легчает последующую работу. Последовательность 5I-CATATG-3I

, ШМ1 ,

3 -GTATAC-5 0 включает

5-ATG-3 HI , З-ТАС-5 ,

которая кодирует аминотерминальную метионильную группу DACS/DAOCS. Плазмида построена так, что промотор рЬ и последовательности, активирующие трансляцию, расположены,

беспечивая экспрессию ДНК, кодирую- ей DACS/DAOCSс,

При.температуре 42tfC E.coli K12 I ii 109/pIT507. экспрессируется DACS/ j /DAOCS (15% от общего клеточного елка). Сырые клеточные экстракты т этих E.coli K12 JM 109/pI507 (трансформант) способны катализироать конверсию пенициллина N в DAOS DAS, в то время как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток E.coli K12 JM 109 не могут катализировать эту конверсию.

Многие штаммы E.coli К 1.2.обладают активностью эндогенной цефалоспори- назьц кодированной локусом ampC При этом осуществляют частичную очистку полипептида DAOCS/DACS так, что достигается оптимальная активность DAOCS/DACSо Для этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕ- тривакрила для отделения эндогенной E.coli цефалоспориназы от фермента DAOCS/DACS. Для исключения вредных влияний цефалоспориназы используют штамм, дефектный по данному ферменту. Один такой штамм E.coli K12 А85 892 находится на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером NRRLB-18096.

Плазмиды и эффективно продуцируют большие количества DACS/DAOCS в E.coli. E.coli pIT507 продуцирует DACS/DAOCS в количестве, приб лижающемся к 15% от общего клеточного белкаv Ввиду того что культивирование E.coli менее сложно,, трансформан ты E.coli рИ507 могут быть использованы в способе продуцирования DACS/DAOCS более эффективно и более экономично, чем естественные продуценты DACS/DAOCS.

DAOCS может быть использована для продуцирования DAOCS из пенициллина N в свободной от клеток системе. DAOS является не только полезным антибиотиком, но также может быть использован в качестве исходного материала для продуцирования таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспорины. DACS/DAOCS используют для трансформации пенициллинов иных, чем пенициллин N, в новые цефалоспо-4- риновые производные.

Свободные от клеток экстракты пенициллина и образующих цефалоспорин организмов могут использоваться для синтеза не имеющих природного происхождения |3-лактамов. Предлагаемые

5

векторы экспрессии E.coli могут быть использованы в способе получения DACS/DAOCS для трансформации пенициллинов, которые в естественном виде в природе не встречаются, для образования новых антибиотиков или структур с антибиотическим ядром.

Плаэмида пригодна для получения DACS/DAOCS в Eccoli не только из-за высоких уровней экспрессии фермента в этих клетках и из-за наличия маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы кодируют/5- лактамаэу и клетки, содержащие этот вектор, и могут расти в присутствии некоторых /3-лактамовых антибиотиков, таких как ампициллин. Однако, если желательно использовать свободный

Q от клеток экстракт, содержащий DACS/ /DAOCS для целей построения /3-лакта- мов, то нежелателен экстракт, который содержат активность К-лактамазы. Так, плазмида не кодирует -лакта5 мазу, а использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, не реагирующий с й-лактамами. Осуществляют замену цистеиновой группы в положении 100 на серии в кодирующей зоне DACS/DAOCS плазмиды данного вектора экспрессии. Этот обычный способ может использоваться для замены любой группы на любую из других 19 естественно кодированных ами0

5

0

нокислот-

5

Сращивание в условиях in

vitro мутантных генов, создаваемых таким образом, позволяет продуцировать белки с комбинациями мутаций. Такой мутант DACS/DAOCS получен с помощью .

Изменение количества генетической информации (вызывающее таким образом вставку или делецию аминокислот в полученном белке) в кодирующей последовательности DACS/DAOCS ДНК изменяет соответственно кодированную аминокислотную последовательность.

Существует целый ряд плазмид, который увеличивает внутриклеточную концентрацию фермента DACS/DAOCS транс0 формированной клетки, содержащих: ДНК, кодирующую фермент DACS/DAOCS; промотор и последовательность, активирующую трансляцию, оперативно связанную с геном DAOC/DAOS. Стойкие

5 трансформанты могут быть получены лишь, если данный вектор воспроизводится либо как внехромосомный элемент, либо как интегрированный в геномную ДНК в клетке хозяина. Описанные плазмиды включают также ген, придающий тойкость к антибиотику, либо какой- ибо другой элемент, который обеспеивает средство отбора клеток хозяев, которые содержат данный вектор, но такие отбираемые элементы могут от- сутствовать, когда вектор интегриуется в хромосомную ДНК клетки хозяина.

Векторы экспрессии в Penicillium и Cephalosporium описаны следующим образом.

Плазмида pPS56 представляет собой вектор экспрессии Cephalosporiunu лазмида pPS55 представляет собой промежуточный продукт в построении плазмиды pPS56. Плазмида pPS55 постоена из Hind III фрагмента плазмиды MLC12 ,3 т.п.о. Hind III фрагента плазмиды pPS34, который включает промотор C,acremonium IPS, слитый с кодирующей последовательностью гид- ромицин В фосфотрансферазы. Фрагмент Bam HI 7 кв, содержащий ген DACS/ /DAOCS плазмиды , слит с частич- но обработанной Bam HI плязмидой pPS 55, образуя плазмиду pPS 56.

Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующая трансляцию на плазмиде , расположены так, чо вызывают экспрессию ДНК, кодирующей фермент с активностью синтетазы DACS/DAOCS, ввиду того, что при построении плазмиды никаких делеций или вставок, действующих на промотор непоследовательность, активирующую трансляцию, не вводится в ДНК, граничащую с 51 -концом.

Ген Penicillium IPS может быть встроен в высоко продуцирующие штаммы Penicillium с целью увеличения титра пенициллинов, продуцируемых при ферментации.

Плазмиды p3SR2, pPS51, pPS52, pPS54 и pPS61 содержат ген amds и клетки Penicillium, заключающие эти плазмиды, и могут быть отобраны с использованием ацетамида„ Плазмиды PPS57 и pPS62 содержат гибридный ген, придающий стойкость к гидромицину, который использует плазмиды pPS59, в результате чего получают плазмиду pPS61. Плазмида pPS61 предназначена для экспрессии фермента DACS/DAOCS Penicillium, особенно P.chrysogenum

Плазмиду pPS51 используют в качестве источника ацетамидного гена в других плазмидных построениях. Плаз- мида pPS52 содержит ген DACS/DAOCS

o

5

0

5

0

5

0

5

0

S

на фрагменте л/7 т.п„о. Bam HI (от плазмиды pPS51) и синтезированную связывающую молекулу. Плазмида pPS52 обеспечивает экспрессию фермента DACS/DAOCS. Плазмиду pPS52 используют для экспрессии фермента Cephalosporium либо в Penicilliunio

Отбираемый маркер amds может быть введен в любой вектор экспрессии. Вектор pPS54 включает ген amds от плазмиды pPS51 и ген Penicillium IPS. Штаммы Penicill-ium обладают некоторой стойкостью к гидромицину. Оптимальные условия трансформации для использования HmR как отбираемого маркера требуют добавления чувствительных к гидромицину агентов Способ отбора трансформантов Penicillium предлагает трансформацию рекомбинант- ной ДНК, включающей ацетамидный ген, клетки хозяина Penicillium, а также культивирование трансформированной клетки в среде роста., которая содержит ацетамид как единственный источник углерода или азота.

Источником ацетамидазного гена (amds) от Aspergillus nidulans может быть плазмида p3SR(NRELB-18182),

Создан промежуточный вектор, обозначенный как пла-змида pPS51, который состоит из гена amds от плазмиды p3S2, слитой с плазмидой pMLC12. Плазмиду pPS51 гидролизуют рестриктазой Hind III, обрабатывают фрагментом Кленова и сшивают с фрагментом 2,13 т.п.о., предварительно с затупленными концами, содержащим гибридный ген DACS/ /DAOCS, в результате чего получают плазмиду pPS60. Плазмида pPS60 содержит промотор Penicillium IPS, расположенный рядом, для экспрессии кодирующей последовательности DACS/DAOCS. Осуществляют делецию двух небольших ограничительных фрагментов Xbal из плазмиды рРЬбО, создающей плазмиду рРЬ58, Синтезированный связывающий фрагмент встраивают в Xbal; что обеспе- чивает операбельное связывание промото-, pa Penici Ilium I IPS и кодирующей посАе-- довательности DACS/DAOCS, в результате получая плазмиду ppS59. Плазмиду pPS59 используют для выражения активности DACS/DAOCS в клетках в Penicillium и других клетках, в которых функционирует промотор Penicillium IPS.

Плазмида pPS59 является промежуточным продуктом для построения векторов экспрессии. Penicillium DACS/DAOCS

pPS 62 и pFS61. Б обоих случаях фрагмент 2,1 т.п.о. Bam HI - Nru I плаз- мйды pPS59 с затупленными концами посредством фермента Кленова используется как источник кодирующей последовательности DACS/DAOCS, слитой с промотором Penicillium IPS. Плазмиды pPS61 и pPS62 содержат отбираемые маркеры на Penicillium,. Осуществляют слияние фрагмента 2,13 кв плазмиды pPS59 с расщепленной Hind III и обра ботанной фрагментом Кленова плазми- дой pPS57 и получают плазмиду pPS62. Плазмида pPS62 является вектором экспрессии.

Промотор DACS/DAOCS Cephalospori- um acremonium также может функционировать в Penicillium (обсуждение плазмида pPS52 приведено), но оптимальные векторы выражения Penicillium используют промотор от гена Peni- cniiura. Промотор Penicillium IPS от плазмиды pLCI (NKRLB-181 81) связан со скелетом плазмиды pMLC12 с помощью синтезированной связующей молекулы, в результате чего продуцируется плазмида ppS53. Плазмида pPS53 является промежуточным продуктом в построении некоторых других клонирующих векторов и плазмид экспрессии. Содержащий промотор фрагмент Bam ,0 кв плазмиды pPS53 слит с фрагментом, кодирующим последовательность ,3 т.п0о. Bam HI плазмиды pPS55, в результате чего образуется плазмида pPS57.

Плазмида pPS57 является промежуточным продуктом в построении вектора экспрессии Penicillium pPS62. Плазмида pPS62 содержит отбираемый маркер (HmR) и гибридньй DACS/DAOCS ген с кодирующими последовательностями как DACS/DAOCS, так и HmR под контролем промотора (2 копии) гена Penicillium

IPS.

Вектор экспрессии Penicillium DACS/DAOCS без отбираемого маркера построен путем вставки содержащего промотор фрагмента 1,0 т„п.о. Bam HI плазмиды pPS53 в точку Bgl II вектора

t

выражения pIT511 E,coli ДНК, кодирующей фермент DACS/DAOCS. Плазмида и производные, которые содержат цельй ген DACS/DAOCS, используются для повышения способности к продуцированию антибиотика Cephalosporium ъ родственных им клеток реципиентов, в которых функционируют промотор C Jac

5

remonium и последовательность, активирующая трансляцию Плазмида pPS56 включает также придающий стойкость к гидромицину ген, который функционирует в С.acremonium и позволяет осуществлять отбор трансформантов С.acremonium pPS56.

После отбора трансформант Cepha- losporium acremonium pPS56 нет необходимости в поддержании давления отбора гидромицина В в среде роста. Отборочное давление не требуется, поскольку трансформанты С.acremonium pPS56 очень стойки. Эта стабильность является результатом трансформации плазмидой pPS56, С о acremonium через хромосомную интеграцию.

Трансформированные клетки Penicillium могут быть отобраны с использованием гидромицина В0

Предлагается способ конверсии пенициллина G и пенициллина V в соответствующие цефалоспоримы с использованием DACS/DAOCS в Penicillium, который включает трансформацию клетки хозяина Penicillium вектором реком- бинантной ДНК, который содержит ген, кодирующий выражение активности DAOCSo

Плазмида включает геномную ДНК, составляющую более чем 3 кв, которая расположена ниже ДНК, кодирую- щей DACS/DAOCS в геноме Cephalospo- rium acremonium. Плазмида pIT503 включает промотор и последователь- ность, активирующую трансляцию гена DACS/DAOCSс

Плазмиды pIT503, pPS52 и pPS56 включают- промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующую трансляцию гена DACS/ /DAOCSo -Промотор С.acremonium и последовательность, активирующая трансляцию, расположенные на плазмидах PIT503, pPS52 и pPS56, могут быть использованы для экспрессии целого ряда последовательностей ДНК. Последовательность промотора С.acremonium и последовательность,активирующая трансляцию, закодирована на фрагменте 440 вр Sst I - Hind III, расположены непосредственно над и в непосредственном соседстве с кодирующей последовательностью DACS/DAOCS. Фраг- мент, который включает указанный ограничительный фрагмент/v440 п.о. Sst I - Hind III, включает промотор С.acremonium и последовательность, активирующую трансляцию.

0

5

0

S

0

Последовательность промотора Сер- halosporium acremonium и последова- те льность, активирующая трансляцию, закодированы на плазмиде . Плаз мида содержит фрагмент 440 п.о. Ssc I -. Hind III,

Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующая трансляцию, могут быть использованы для экспрессии гетерологичной последовательности ДНК. Влияние промотора DACS/DAOCS с геном, стойким к бактериальному гидромицину В, позволяет использовать отбор с использованием гидромицина В в Cephalosporium. Описана последовательность окончания транскрипции и другие ре- гуляторные сигналы в 3 -конце гена DACS/DAOCS. Плазмида и ее производные, такие как плазмида /pPS56, содержат дополнительно ДНК более чем 1 т.п.о. ниже точки начала транскрипции гена DACS/DAOCS в геноме Cephalosporium acremonium.

Часть этой З -регуляторной ДНК последовательности известна и описана следующим образом.

З -ТАС-З . является трансляционной концевой последовательностью:

GGA АСС CGC ССА ТОП AGT ААТ ААА ТСТ ACG GGA GTT TAA GAA GAA AAA TTG CCC TAT AAA TTG СТА ААТ TIT TAA AAC АСА AAG CAT GAG TGT CAA GAG TTT CAA GTT TCA A-3 Данная последовательность и последовательности, включающие З -регу- ляторные последовательности гена DACS/DAOCS, могут быть введены в векторы экспрессии рекомбинантной ДНК

Осуществлено впервые клонирование последовательности, которая кодирует фермент DAOCS. Кроме того, как аминокислотная, так и ДНК последовательность фермента экспандазы, особенно DAOCS синтетазы Cephalosporium acremo- , nium, могут быть использованы для отделения ДНК, кодирующей экспандазу от про дуцирующих --лактам организмов, Данная последовательность ДНК может быть использована для приготовления меченых проб, предназначенных для обнаружения кодирующих экспандазу последовательностей ДНК в продуцирующих лактам организмах. Содержание G и С в кодирующих DAOCS ДНК, составляющие примерно 63%, приводит к тому, что данные ДНК пригодны для выделения ДНК Sfcreptomyces, кодирующей DAOCS, в основном S. clavaligerus. ДНК

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Streptomyces имеет высокое содержание G и С и достигает 70% Такое высокое содержание G и С в ДНК позволяет использовать их для выделения гомологичных S.slavaligerus или других последовательностей ДНК, кодирующих DAOCS.

Пример 1. Культура Е„соН К12 JA 221/р1Т508 и выделение плаз- миды .

1 л питательного бульона L (10 п триптона, 10 г NaCl и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инокулируют культурой E.coli K12 JA 221/pIT503 и инкубируют в инкубаторе при 37 С до тех пор, пока оптическая плотность при 590 нм не составит 1 ед. поглощения. В течение этого времени в культуру вводят 150 мг хлорамфени- кола Инкубацию продолжают в течение 16 ч. Введение хлорамфеникола инги- бирует синтез белка л, таким образом, ингибирует дальнейшее деление клеток, но обеспечивает дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют при скорости вращения 6000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Полученный по- 1 верхностный слой удаляют и клеточную гранулу промывают в 40 мл TES буферного раствора (10 мМ трис-HCl; рН 7,5; 10 мМ NaCl и 1 мМ этилендиамин- тетрауксусная кислота (ЕДТА) и затем снова гранулируют. Поверхностный слой удаляют и клеточную гранулу замора- жив ают в баке со смесью сухой лед - этанол, а затем оттаивают. Оттаянную клеточную гранулу снова суспендируют в 10 мл раствора 25%-ной сахарозы и 50 мМ ЕДТА. В данный раствор вводят и перемешивают с ним 1 мл лизо- цимного раствора концентрацией 5 мг/мл; 3 мл 0,,25 М ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл рибонуклеазы А концентрацией 10 мг/мл. Затем эту смесь инкубируют на льду в течение 15 мин.

В обработанные лизоцимом клетки вводят 3 мл лизирующего раствора (приготовленного смешиванием 3 мл 10%-ного тритон-Х 100,75 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,0, 15 мл 1 М трис-HCl, рН 8,0 и 7 мл воды), перемешивают и полученный раствор инкубируют на льду в течение еще 15 мин. Лизированные клетки замораживают в бане со смесью сухой лед - этанол, а затем оттаивают.

Клеточные осколки удаляют из раствора путем центрифугирования при вращении центрифуги со скоростью 25000 об/мин в течение 40 мин0 Поверхностный слой экстрагируют буферным фенолом. В этот раствор вводят 30,44 CsCl и 1 мл раствора этилбро- мида концентрацией 5 мг/мл. Затем i этот раствор доводят до объема 40 мл и декантируют в ультрацентробежную трубку. Эту трубку герметически Запаивают и раствор центрифугируют в роторной центрифуге при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч. Полученную плазмиду, визуализированную ультрафиолетовым светом, выделяют а затем помещают в трубку и роторную центрифугу, где осуществляют центрифугирование1 со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч. Любое необходимое регулирование объема осуществляют с использованием раствора ТЕЗ, содержащего 0,761 мг/мл CsCl. Затем плаз- мидную полосу выделяют, экстрагируют насыщенной солью изопропанолом с целью удаления этилбромида, и разбавляют (1:3) буферным раствором ТЕЗ, В раствор вводят два объема этанола и затем его инкубируют при -20е7 С в течение ночи. Плазмидную ДНК гранулируют путем центрифугирования данного раствора в роторной центрифуге в течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 об/мин.

ДНК плазмиды р 1Т503, полученную таким путем (1 мг), суспендируют в 1 мл буферного раствора TES (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) и хранят при -20°С.

Последовательности концевого ко- дона, кодирующей последовательности 1рр, замещают на Bam HI путем ввода синтезированной связующей молекулы ДНК (5 -CCGGATCCGG-3). Кодирующая последовательность последних тридцати пяти аминокислот липопротеина, трансляционный концевой сигнал и последовательность,- соответствующая 3 -нетранслированной зоне информационой РНК, следует за точкой Ват Н1„ Плазмида рКЕ N021 включает также некоторые независимые последовательности на 850 т0Поо., расположенные ниже гена 1рр в хромосоме Е.соН.

Примерно 50 мкг плазмиды pKENIII обрабатывают с 25 рестриктазами Hpal в 300 мкл буферного раствора IX Нра

0

5

(10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgCl2, 1 мМ КС1; и 6 мМ |3-меркаптоэтанола) при 37°С в течение 2 ч. Смесь экстрагируют двукратно 300 мл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50 и извлеченную водную фазу повторно осаждают 2,5 об. этанола и 0,1 об 3 М NaOAc. Гранулу ДНК растворяют в 100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле.

П р и м е р 2. Построение плазмиды рГГ507.

Построение плазмиды pKEN021 и выделение фрагмента 5,1 т.п„о. Xba I - Bam HI осуществляют следующим образом.

Плазмиду pKEN021 получают из 0 плазмиды pKENIIIo Плазмиду pKENIII получают из Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL), служба исследований в области сельского хозяйства, Перория, Илли- 5 нойс, 61604, EoColi СС620, порядковьй номер NRRL 1501 К

Плазмида pKENIII имеет фрагмент л-2,8 к EcoRI, которьй включает ген E.coli 1pp.

В плазмиде pKEN021 фрагмент 650 bp EcoRI - Sal I плазмиды pBR322 замещают генной последовательностью E.coli 1pp. Эти генные последователь- ности 1рр включают фрагмент 462 п„о. Alu I, расположенный кверху от первого триплета кодирующей последовательности 1рро Этот фрагмент л/462 Ьр содержит промотор 5 -нетранслированную зону и точку рибосомного связывания. 0 Уникальный сайт рестрикции Xbal расположен в пределах точки рибосомного связывания 16 то перед метионином, инициирующим трансляции. Сайт рестрикции Pvu, находящийся выше бис, составляет 29:1 во всех полиакрил- амидных гелях,за исключением особых случаев. Этот гель окрашивают в растворе, содержащем 0,5 мкг/мл этилбромида, и визуализируют полосу ДНК в длинноволновом ультрафиолетовом свете Фрагмент 950 п.о. Hpall изолируют и извлекают из геля путем электро- элюнрования в диализный мешок. После экстракции смесью фенол/СНСЦ и осаждения этанолом, ДНК (2,5 мкг) растворяют в 25 мкл TEN (10 мМ NaCl; 10-мМ трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА).

Примерно 2 мкг фрагмента 950 п.о. .Hpall обрабатывают ферментом Alu I

0

5

5

0

5

21

в 200 мкл раствора IXAlu I (50 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,6, 6 мМ MgCl и 6 мМ /3-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37°С. ДНК фракционируют в 6%-ном полиакрипамидном геле, фрагмент 462 По о. Alu I извлекают, (A/I мкг) .растворяют в 10 мл раствора (66 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl,, 10 мМ дитиотреитол, 0,4 мМ АТР), содержащего 150 пмоль фосфорилированно- го связующего звена EcoRI р -ССААТТСС-З ) и 2 ед. Т4 ДНК-лига- ъзы. После инкубации при 4°С в течение 16 ч смесь прогревают при 65°С в течение 10 мин и разбавляют до состава раствора: 100 мМ трис-HCl, рН 7,2, 50 мМ NaCl, 10 мМ 6 мМ/3-мер- каптоэтанол, содержащего 40 ед„ фермента EcoRI. Через 2 ч выдержки при 37°С образец экстрагируют смесь фе- нол/СНС1 и осаждают этанолом. Затем ДНК растворяют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего Т.4 ДНК-лигазу и 0,1 мкг обработанной щелочной фосфатазой и ферментом EcoRI плазмиды pBR3220 После сшивки при 4 С в течение 16 ч ДНК используют для трансформации E.coli K12 НВ101 (NRRLB-15626). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции. Плазми- да, содержащая фрагмент 466 п.о. Xba I - Bam HI, использована в качестве исходного материала для следующего этапа.

Примерно 2 мкг этой плазмиды, обработанной 2 ед. фермента Hind III в 50 мкл буферного раствора IX Hind III (60 мМ NaCl; 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgClgH 6 мМр-меркап- тоэтанол) в течение 1 ч при 37°С, экстрагируют смесью фенол/СШЛ осаждают этанолом, растворяют в 200 мкл буферного раствора нуклеазы IX SI (300 мМ NaCl; 30 мМ NaOAc, рН 4,25, 3 мМ ZnCLj) и обрабатывают 200 ед. иуклеазы S1 в течение 1 ч при 15°С. Реакцию прекращают путем экстракции смесью фенол/СНС1з, ДНК осаждают этанолом. Обрабатывают ферментом Hind III, растворяют в 10 мл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего 20 пмоль фосфорилирован- ных связующих звеньев Bam HI (S -CCGGATCCGG-S) и 2 ед. Т4 ДНК- лигазы. После 16 ч инкубации при

10

15

20

65°С в течение 10 мин и затем раз бавляют до 100 мл до получения бу ферного раствора IX Bam HI (150 м NaCl; 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 6 мМ /$-меркаптоэтанол), со держащего 20 ед. фермента Ват Н1„ После 2 ч инкубации при 37°С смес подвергают очистке в 1%-ном агаро ном геле. Этот гель окрашиваются этилбромидом, и более крупный фра мент (4,5 т.п.о.) извлекают из г ля.

Фрагмент имеет когезионно связ ные концы Bam HI. Его растворяют 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигазы, содержащего лигазу Т4.ДНК Через 16 ч выдержки при 4°С ДНК и пользуют для трансформации Е„со1г К12 НВ101 (NRRLB-15626)о Трансфор ты отбирают на устойчивость к амп циллину при 100 мг/мл и на чувств тельность к тетрациклину при 10 м /мл. Плазмиды отобранных колоний следуют на отсутствие точки Hind и на присутствие единственной точ Ват Н1 Последовательный гидролиз EcoRI, Sail приводит к образовани двух фрагментов размером 46b и 3X п.о. и значительно более длинного фрагмента. Плазмиду с такими хара теристиками модифицируют для прев щения точки EcoRI, расположенной ше промотора 1рр, в ограничительн точку Hind III.

Модификацию проводят путем час тичного гидролиза 2 мкл плазмиды 100 мкл буферного раствора IX Eco с ограничительным ферментом EcoRI Реакцию прекращают нагреванием пр 40 651. ДНК экстрагируют смесью фен /СНС1 и осаждают этанолом. ДНК р воряют в 200 мл буферного раствор нуклеазы IX S1, содержащего 1000 /мл нуклеазы S1, и инкубируют при

25

30

35

45 120С в течение 1 ч. Реакцию прекр щают экстракцией смесью фенол/CHC ДНК осаждают этанолом и суспендир в 10 мкл буферного раствора Т4 ДН лигазы, содержащего 20 пмоль фосф

50 рилированного связующего звена Hin III (5 -CCAAGCTTGG-3 H 2 ед. Т4 Д лигазы. После 16 ч инкубации при смесь нагревают в течение 10 мин п 65°С, разбавляют до 150 мкл с полу

55 чением композиции буфера IX Hind I |содержащего 10 ед. ограничительног фермента Hind III, инкубируют в те чение 2 ч при 37°С и затем фракцио

.4 С реакционную смесь нагревают при -ч . руют в 1%-ном агарозном геле. ДНК

10

15

20

73985622

65°С в течение 10 мин и затем разбавляют до 100 мл до получения буферного раствора IX Bam HI (150 мМ NaCl; 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ 6 мМ /$-меркаптоэтанол), содержащего 20 ед. фермента Ват Н1„ После 2 ч инкубации при 37°С смесь подвергают очистке в 1%-ном агароз- ном геле. Этот гель окрашиваются этилбромидом, и более крупный фрагмент (4,5 т.п.о.) извлекают из геля.

Фрагмент имеет когезионно связанные концы Bam HI. Его растворяют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигазы, содержащего лигазу Т4.ДНК. Через 16 ч выдержки при 4°С ДНК используют для трансформации Е„со1г К12 НВ101 (NRRLB-15626)о Трансформанты отбирают на устойчивость к ампициллину при 100 мг/мл и на чувствительность к тетрациклину при 10 мкг/ /мл. Плазмиды отобранных колоний исследуют на отсутствие точки Hind III и на присутствие единственной точки Ват Н1 Последовательный гидролиз EcoRI, Sail приводит к образованию двух фрагментов размером 46b и 3X15 п.о. и значительно более длинного фрагмента. Плазмиду с такими характеристиками модифицируют для превращения точки EcoRI, расположенной выше промотора 1рр, в ограничительную точку Hind III.

Модификацию проводят путем частичного гидролиза 2 мкл плазмиды в 100 мкл буферного раствора IX EcoRI с ограничительным ферментом EcoRI. Реакцию прекращают нагреванием при 40 651. ДНК экстрагируют смесью фенол/ /СНС1 и осаждают этанолом. ДНК растворяют в 200 мл буферного раствора нуклеазы IX S1, содержащего 1000 ед/ /мл нуклеазы S1, и инкубируют при

25

30

35

45 120С в течение 1 ч. Реакцию прекращают экстракцией смесью фенол/CHCl-jo ДНК осаждают этанолом и суспендируют в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигазы, содержащего 20 пмоль фосфо50 рилированного связующего звена Hind III (5 -CCAAGCTTGG-3 H 2 ед. Т4 ДНК- лигазы. После 16 ч инкубации при 4°С смесь нагревают в течение 10 мин при 65°С, разбавляют до 150 мкл с полу55 чением композиции буфера IX Hind III, |содержащего 10 ед. ограничительного фермента Hind III, инкубируют в течение 2 ч при 37°С и затем фракциони23;

извлекают, очищают, растворяют в 20 мкл буферного раствора Т4-лигазы, содержащего Т4-лигаэу, инкубируют в течение 16 ч при 4°С и используют для трансформации HB101 (NRRL В-15626). Плазмиду ДНК трансформант ApR анализируют , Отбирают плазмиду с фрагментом 500 п.о. EcoRI - Hind III. Эту плазмиду затем используют как вектор для клонирования 3 -зоны гена 1рр 2 мкг этой плазмиды гид- ролизуют в 50 мкл буферного раствора IX Sal I (150 мМ NaCl, 6 мМ трис-НС1 рН 7,9, 6-мМ MgCl2H 6 мМ/3-меркапто- этанрла) с 2 ед. фермента Sal I в тече ние 1 ч при 37°С„ Реакционную смесь разбавляют до 150 мкл с получением композиции буферного раствора Bam HI, содержащего 2 ед. фермента Bam HI. После инкубации 1 ч при 37 С добавляют примерно 2,5 ед. щелочной фос- фатазы и инкубируют при 65 С в течение 1 ч„ ДНК экстрагируют смесью фе- нол/СНС1з, осаждают этанолом, растворяют в TEN и используют как вектор клонирования для фрагмента 3 -1рр.

Для получения фрагмента 1ррЗ 10 мкг плазмиды pKENIII гидролизуют в 200 мкл буферного раствора IX Hpal содержащего 10 ед. фермента Hpal, в течение 2 ч при 37 С. После экстракции смесью фенол/СНС и осаждения этанолом ДНК растворяют в 10 мкл буферного раствора Т4-лигазы ДНК, содержащего 20 пмоль фосфорилирован- ного связующего звена Sal I (5 -GGTCGACC-37) и Т4 ДНК-лигазу. Инкубируют в течение 16 ч При 4° С. Ли- газу инактивируют путем нагревания при 63°С в течение 10 мин. Полученны материал разбавляют до объема 100 мкл получают композицию буферного раствора IX Sal I, содержащего 10 ед. фермента Sal I, и инкубируют в течение 1 ч при 370С. Реакционную смесь разбавляют -До 300 мкл, получают; композицию буферного раствора IX Pvu II (60 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,5, 6 мМ 6 мМ уЗ-меркаптоэтанол), содержащего 10 ед. фермента Pvu II Через 1 ч инкубации при 37°С ДНК фракционируют в 5%-ном полиакриламид ном геле. 0,5 мкг фрагмента 950 п.о„ извлекают, очищают и-растворяют в TEN.

0,2 мг этого фрагмента разбавляют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигачы, содержащего 20 пмоль фосфори

1

,

10

15

20

739856

лированного связующего звена Bam HI (5 -CCGGATCCGG-37) и 2 ед. Т4 ДНК- лигазы, и инкубируют в течение 16 ч при 4°С. Полученную ДНК нагревают в течение 10 мин при 65°С, разбавляют до объема 100 мкл с образованием композиции буферного раствора IX Bam HI, содержащего 20 ед. фермента Bam HI, инкубируют при 37flC в течение 2 ч и затем фракционируют в 5%-ном полиак- риламидном геле с целью удаления избытка связующих молекул

Полученный в результате фрагмент 950 п.о. с когезионно связанными концами Bam HI и Sal I очищают и раство ряют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего 0,2 мкг гид- ролизованной Bam HI - Sal I плазмиды 105 и Т4 ДНК-лигазы После инкубации в течение 16 ч при 4 С ДНК используют для трансформации E,coli K12 НВ101 (NRRL B-15626)p Плазмиды клонов анализируют на наличие фрагмента Sal I - 25 Bam HI, и отбирают плазмиду (5,2 т п.о.), которую обозначают pKEN021.

10 мг плазмиды pKEN021 гидролизуют в 200 мл буферного раствора Bam HI, содержащего 10 ед. каждого из ферментов Bam Hi и ХЬа I в течение 1 ч при 37 Сс Затем обрабатывают 2,5 ед« щелочной фосфатазы в течение 1,5ч при 65°С, экстрагируют смесью фенол/СНС осаждают этанолом и растворяют в 50 мл TEN для последующего использования

Построение плазмиды pNM575 ведут следующим образом.

Плазмиду ptrEDSOch GH 800 исполь- д0 зуют в качестве источника ДНК, со- держащей части кодирующей последовательности hGH, которая содержит уни- кальную ограничительную точку, на 6 п.оо ниже трансляционного концевого , кодона данной кодирующей последовательности. Эту точку заменяют на точку Bam HI по описанной методике. 6 мкг плазмиды ptzpEDSOch GH 800 гидролизуют 6 ел Sma I в 200 мл раствот- ра IX Sma I (15 мМ трис-HCl, рН 8,0, 6 мМ MgCl2, 15 мМ КС1 и 6 мМуЭ-мер- - каптоэтанол) в течение 15 ч при 37°С, экстрагируют смесью фенол/СНСЦ, осаждают этанолом и растворяют в 24 мкл TEN, содержащего 40 пмоль фос- форилированного связующего звена Вайи Смесь инкубируют в течение 2 ч при 22°С, в течение 16 ч при 4°С, а затем в течение 10 мин при 65°С.

30

35

45

50

55

Когезионно связанные концевые звенья Bam HI образовываются путем гидроли- за с ограничительным ферментом Bam HI Гидролиз приводит к образованию фрагмента 691 п.о. с когезионно связан- ными концами Bam HI.

Фрагмент ДНК сшивают с 0,2 мкг - гидролизованной Bam HI и обработанной щелочной фосфатазой ДНК плазмиды pBR322o Через 16 ч инкубации при 4°С данный материал используют для трансформации E.coli K12 JA 221 (NRRL В-15014)о Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллинао Плазмиды выделяют и идентифицируют путем анализа ограничительного фермента и методом гель-электрофореза о Желаемые плазмиды, обозначенные как pNM575, содержат фрагмент 700 п„о. Bam HI.

Построение плазмиды рИ01 ведут следующим образом.

Кодирующая последовательность зрелого hGH содержит одну точку Fnu PII, составляющую 47 п.о. от первого нуклеотида трансляционной

5 -CTAGAGGGTATTACATATGGATTTCCCAACCATTCCCCTCTCGAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG-3

И I I t I II l| l I 1 1 II И I И I М I I И I I И I П М II И I И I I I I I 111 1 И П I U | t 3 -TCCCATAATGTATACCTAAAGGGT tGGTAAGGGGAGAGCTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC-5)

Данный фрагмент получают фосфо- триэфирным способом, посредством которого готовят следующие фрагменты:

1)5 -CTAGAGGGTA-3 ;

2)5 -TTACATATGGATTTCC-3 ;

3)5 -CAACCATTCCCCTCTCGAGGC-З ;

4)5 -TTTTTGACAACG-3 ;

5)5 -CTATGCTCCG-3 ;

6)5 -CGGAGCATAGCGTT-3 ;

7)5 -GTCAAAAACCCT-3 ;

8)5 -CGAGAGGGGAAT-3 ;

9)5 -GGTTGGCAAATC-3;;

10)Ь -CATATGTAATACCCT-3 . Используя их осуществляют ступенчатую реакцию катализированного связывания Т4-лигазы:

b - нефосфорилированный сегмент 1 смешивают с фосфорилированными сегментами 2,. 9 и 10 и подвергают воздействию Т4-лигазы с образованием дуплекса 1 ДНК; этот дуплекс извлекают методом препаративного гель- элактрофореза в 15%-ном полиакрилами де;

5 -нефосфорилированный сегмент 6 смешивают с фосфорилированными сегментами 3, 4, 5, 7и8и подвергают воздействию Т4-лигазы ДНК с образованием дуплексной формы ДНК 2; этот

5

5

инициирующей точки. 25 мкг плазмиды рШ575 гидролиэуют в 250 мкл раствора Bam HI с 25 ед„ фермента Bam HI при 37° С в течение 1 ч. Фрагмент 691 п.о. Bam HI извлекают из 6%-ного полиакрил анидного геля и очищают Одну треть этого фрагмента (эквивалентно 8 мкг плазмиды) гидролизуют в 100 мкл раствора Fnu PII (6 мМ NaCl; 6 мМ трис-HCl, рН 7,4, 6 мМ MgCl и 6 мМ |3-меркаптоэтанол) с 2,5 ед. фермента Fnu PII в течение 1,5 ч при 37вС. Электрофорез в 6%-ном полиакриламид- ном геле и стандартные процедуры извлечения используют для извлечения фрагмента ДНК 538 п.о., содержащего кодирующую последовательность послед- , них 175 аминокислот hGH, после чего осуществляют трансляцию стоп-сигнала.

Двунитевой фрагмент ДНК синтезируют юсфотриэфирным способом, соединяя зону промотора 1рр с кодирующей зоной hGH. Этот двунитевой фрагмент ДНК имеет следующую последовательность:

дуплекс очищают электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле;

ДНК дуплексы 1 и 2 соединяют вместе посредством Т4-лигазы, образуя ДНК

дуплекс 1100, который очищают электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле; этот ДНК дуплекс ферментно фос- форилируют с использованием Т4-поли- нуклеотидкиназы и Ј-32 Р-АТР, посредством описанной процедуры.

Плазмиду строят путем сшивания 0,1 пмоль (0,4 мкг) фрагмента Xba I - Bam HI плазмиды pKEN021, 0,025 пмоль синтезированного фрагмента ДНК и 0,3 пмоль (0,08 мкг) фрагмента 538 п„ о „ плазмиды pNM575 в 24 мкл раствора с использованием Т4-лйгазы ДНК. После инкубации в течение 1Ь ч при 4°С смесью трансформируют E.coli JA 221 (NRRL B-15014) Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 110 мкг/мл ампициллина, и культивируют.

Построение плазмиды рИОЗ ведут

следующим образом.

Последовательность гена hGH в плазмиде содержит точку Xho I на 24 основания ниже трансляционной инициирующей точки и точки vXba I в

некодирующей зоне 5. 25 мкг плазмиды гидролизуют в 250 мкл раствора Bam HI с 25 ед. ХЬа I и 25 ед. Xho I при 37°С в течение 1 ч. Больший фрагмент очищают от агарозного геля по описанной методике,

Двунитевой фрагмент ДНК синтезируют фосфотриэфирным способом с вводом короткой открытой рамки считывания (цистрон) в переднюю часть коди5 -CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCATATGGATTTCCCAa -TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCCTCCTTAGTATACCTAAAGGGT

1)5 -CTAGAGGGTATTAATAATGCATATTGATTTTAATAAGGAG-З ;

2)5 -GAATAATCATATGGATTTCCCAACCATTCCCCTC-3 ;

3)5 -TCGAGAGGGGAATGGTTGGGAAATCCATATGATTATTCCTCCTT-3

4)5. -АТТААААТСААТАТАСАТТАТТААТАСССТ-3

Используя приготовленные сегменты, осуществляют соединение путем смешивания 5 - нефосфорилированных сегментов 1 и 3 с 5 -фосфорилированными i сегментами 2 и 4 и воздействия на данную смесь Т4-лигазой. Полученный дуплекс очищают путем электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. ДНК дуплекс затем ферментно фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеаотидосмесь инкубируют при 16°С в течение 1 ч, реакцию завершают путем экстрак ции фенолом и ДНК очищают. Гидроли- зованную Nde I и обработанную фрагментом Кленова ДНК сшивают Т4-лигазо 25 ДНК при 4°С в течение 16 ч. Полученную ДНК используют для трансформации RV308 штамма E.coli K12 (NRKL В-15624). Трансформанты отбирают на L-агаровых пластинах, содержащих

. ...™.L™a3 ЗО Юо мкг/мл ампициллинаГплазмвды отмиду LGH рПОЗ строят путем сшивки 0,1 пмоль (0,4 мкг) фрагмента Xba I - Xho I плазмиды с 0,025 пмоль синтезированного фрагмента ДНК в 24 мкл раствора, с использованием Т4- лигазы ДНК. После инкубации в течение 1Ь ч при 4° С смесь используют для трансформации E.coli JA 221 (NRRL B-1S014). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивируют.

Построение E.coli К1 2 RV 308/ /pL 110 А ведут следующим образом.

1 мкг плазмиды pL110 ДНК гидроли- зуют 3 ед. фермента Nde I в объеме 20 мкл раствора 1,0 М NaCl, 0,50 М трис-HCl, рН 7,5, 0,10 мМ MgCl2 и 10 мМ дитиотритиола в течение 1 ч при 37°С, экстрагируют смесью фенол/хлороформом и осаждают этанолом. ДНК плазмиды pLIlO растворяют в 50 мкл раствора Кленова IX (40 мМ КРОи, рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2, 1,0 мМ 2-меркапто- этанол, 33 мкМ d-ATP 33 мкМ d CTP; 33 мкМ d-GTP и 33 мкМ ТТР). Два мкл ( 10 ед.) крупного фрагмента ДНК по гюлимеразы 1 E.coli, известного как фрагмент Кленова, вводят в данную ДНК и смешивают с ней. Реакционную

35

40

45

деляют от полученных колоний путем быстрой щелочной экстракции. Так отбирают плаэмиду рЫЮА, не содержащую точку Nde It

Построение фага pLMOB путем точечно-специфического мутагенеза проводят следующим образом.

Для построения фага М13ТсЗ 50 мкг плазмиды рЫЮВ в 50 мкл раствора TEN вводят в 25 мкл раствора 10Х Hind III и 170 мкл воды, добавляют 5 мкл (V50 еде) фермента Hind III и инкубируют при 37°С в течение 2 ч„ Добавляют 13 мкл 2 М трис-HCl, рН 7,4 и 5 мкл (50 ед) фермента EcoRI и инкубируют в течение более 2 ч при 37°С. Реакцию прекращают экстракцией

фенолом, насыщенным TEN, фенол удаляют путем экстракции хлороформом. ДНК плазмиды рЫЮ осаждают, центрифугируют, проводят электрофорез в 1%-ном агарозном геле и выделяют фрагмент EcoRI - Hind III 4,3 т.п.о

Примерно 5 мкг ДНК фага m13mp18 55 растворяют в 50 мкл раствора ТЕ, гид- ролизуют Hind III и EcoRI ферментами как описано, обрезая Hind III - EcoR и очищают фрагмент размером ,25 т. п.о.

рующей последовательности hGH. Этот двунитевой ДНК фрагмент имеет указанную последовательность:

АССАТТССССТС-3 TGGTAAGGGGAGAGCT-5

(О

Данный фрагмент получают методом распознавательного фосфотриэфирного способа, посредством которого получают следующие сегменты:

смесь инкубируют при 16°С в течение 1 ч, реакцию завершают путем экстракции фенолом и ДНК очищают. Гидроли- зованную Nde I и обработанную фрагментом Кленова ДНК сшивают Т4-лигазой ДНК при 4°С в течение 16 ч. Полученную ДНК используют для трансформации RV308 штамма E.coli K12 (NRKL В-15624). Трансформанты отбирают на L-агаровых пластинах, содержащих

Юо мкг/мл ампициллинаГплазмвды от5

0

5

деляют от полученных колоний путем быстрой щелочной экстракции. Так отбирают плаэмиду рЫЮА, не содержащую точку Nde It

Построение фага pLMOB путем точечно-специфического мутагенеза проводят следующим образом.

Для построения фага М13ТсЗ 50 мкг плазмиды рЫЮВ в 50 мкл раствора TEN вводят в 25 мкл раствора 10Х Hind III и 170 мкл воды, добавляют 5 мкл (V50 еде) фермента Hind III и инкубируют при 37°С в течение 2 ч„ Добавляют 13 мкл 2 М трис-HCl, рН 7,4 и 5 мкл (50 ед) фермента EcoRI и инкубируют в течение более 2 ч при 37°С. Реакцию прекращают экстракцией

фенолом, насыщенным TEN, фенол удаляют путем экстракции хлороформом. ДНК плазмиды рЫЮ осаждают, центрифугируют, проводят электрофорез в 1%-ном агарозном геле и выделяют фрагмент EcoRI - Hind III 4,3 т.п.о.

Примерно 5 мкг ДНК фага m13mp18 5 растворяют в 50 мкл раствора ТЕ, гид- ролизуют Hind III и EcoRI ферментами, как описано, обрезая Hind III - EcoRI, и очищают фрагмент размером ,25 т. п.о.

29

100 нг фрагмента ,3 т0п,о. Hind III - EcoRI плазмиды рЫЮ смешивают с 100 нг фрагмента/ 7,25 т.п, о. Hind III - EcoRI фага М13 mp18, 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х,

1мкл ед„) Т4-лигазы ДНК и 1А мкл . Смесь инкубируют при 15°С в течение 1,5 чо

1 мл. ночной культуры E.coli K12 jM 109 E.coli K12 jM 101 используют для инокуляции 50 мл питательного бульона L, полученную культуру инкубируют при 37°С с аэрацией до тех пор, пока O.D.gg0, не достигает значения от 0,3 до 0,4. Клетки повторно суспендируют в 25 мл 10 мМ NaCl, инкубируют на льду в течение 10 мин, собирают центрифугированием, снова суспензируют в 1,25 мл 75 мМ CaClg, аликвоту (200 мкл) этих клеток удаляют, вводят в 10 мкл сшитой ДНК, приготовленной как указано, и инкубируют на льду в течение 40 мин. Затем инкубируют при 42°С в течение

2мин, аликвоты (1, 10 и 100 мкл) удаляют и вводят в 3 мл верхнего агара (L питательный бульон с 0,5%- ным агаром, поддерживаемом в расплав1 ленном состоянии при 45°С), который также содержит 50 мкл 2%-ного X-Gal, 50 мкл 100 мМ IPTG и 200 мкм E.coli К12 jM 109 в. логарифмической фазе роста). Смесь клетки - верхний агар помещают на пластины с L агаром, содержащим 40 мкг/мл X-Gal (5-бромо-4- хлоро-37Индолил-|5-В-тиогалактозид)

и 0,1 мМ IPTG (изопропил-В-В-тиога- лактозид). Пластины инкубируют при 37 С в течение ночи.

Прозрачные колонии используют для инокуляции 2 мл питательного бульона L, полученные в результате культуры инкубируют при 37°С с аэрацией в течение 2 ч (отсутствие синего цвета говорит о том, что произошла желаемая вставка ДНК). Затем культуры . центрифугируют и 200 мкл полученного поверхностного слоя вводят в 10 мл культуры (0oD,S5D 0,5). E.coli K12 jM 109, выращенной при 37°С с аэрацией. Эти культуры инкубируют еще в течение 30 мин при 37°С, а затем клетки гранулируют путем центрифугирования и используют для получения репликативной формы рекомбинантного фага, -который они содержат. Двуни- тевую репликативную форму ДНК фага выделяют из клеток с использованием процедуры, описанной в примере 1.

10

15

25

3985630

Трансформанты, содержащие ДНК фага пИЗТсЗ, идентифицируют путем анализа ограничительного фермента их фаговой ДНК о

5 Для получения однониточной ДНК фага т13ТсЗ 1,5 мл ночной культуры E.coli К 12 jM 109/m13Tc3 подвергают центрифугированию и 100 мкл поверхностного слоя, содержащего фаг т13ТсЗ, используют для инокуляции 25 мл культуры E.coli jM 109 при О.Р.6бо 0,4- 0,5. Культуру инокулируют в течение 6 ч при 37°С с аэрированием В течение этого времени культуру центрифугируют и полученный поверхностный слой (20 мл) переносят в новую трубку. 2 мл раствора, содержащего 20% полиэтиленгликоля (PEG) 6000 и 14,6%

2Q NaCl, вводят в этот поверхностный

слой центрифугирования, который затем инкубируют на льду в течедие 20 мин Полученньй поверхностный слой центрифугируют в течение 25 мин. Осадок снова суспензируют в 500 мкл буферного раствора ТЕ Раствор ДНК двукратно экстрагируют насыщенным фенолом ТЕ и двукратно хлороформом. Затем осаждают однонитевую ДНК с использованием NaOAC и этанола, и подвергают центрифугированию Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в 60 мкл Н20.

Мутагенез проводят следующим образом.

35 Фрагмент однонитевой ДНК, используемый в мутагенезе, синтезируют в автоматическом синтезаторе ДНК. Этот фрагмент имеет указанную последовательность:

40 5 -CCCGTCCTGIGGATACTCTACGCCGA-3 Он гомологичен зоне,окружающей точку Bam HI (57-GGATCC-3}) в придающем стойкость к тетрациклину гене плазмиды pBR322, с той разницей, что груп45 па А, вторая от 5 конца (или третья от 31-конца), представляет собой С в плазмиде рВК322 Такая замена не изменяет аминокислотный достав придающего стойкость к тетрациклину бел50 ка, но устраняет точку Bam HI.

Примерно 10 пМ мутантной затравки и универсальной затравки М13 обрабатывают отдельно 10 ед. (BRL) Т4-по- 55 линуклеотидоксиназы в 20 мкл раствора киназы IX (60 мМ трие-HCl, рН 7,8, 15 мМ 2-меркаптоэтанола, 10 мМ MgCl. |И 0,41 мкМ ш-АТР) в течение 30 мин при 37 С. Обработанную киназой ДНК

30

зп

используют в операции мутагенеза, для чего смешивают 300 нг 0,2 мкл) одно- нитевого фага т13ТсЗ, 1 пМ (2 мкл) универсальной затравки, 1 пМ (2 мкл) мутагенной затравки, 2 мкл 10Х ана- неляционного буферного раствора (100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА и 500 мМ NaCl), и 12,8 мкл Н20, инкубируют при 80°С в течение 2 мин, при 50°С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной температуры.

5 мкл раствора 10Х (500 мМ трис- HCl, рН 8, 1 мМ ЕДТА. 120 мМ MgCl), 5 мкл 2 мМ d ATP, 1 мкл 6 мМ раствора в каждом из ТТР и d CTP, 1 мкл ( ед.) фермента Кленова, 1 мкл (100 ед.) Т4-лигазы ДНК и 17 мкл ана- нелированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, при 37°С в течение 2,5 ч и затем в течение ночи при 4°С.

Реакцию останавливают посредством двух экстракций насыщенным ТЕ фенолом и двух экстракций ДНК осаждают этанолом и NaOAc, осаждают центрифугированием, повторно суспензируют в 50 мкл НгО и 6 мкл буферног раствора 10Х 1 добавляют к раствору ДНК.

Раствор ДНК распределяют поровну в три трубки. В две из них вводят примерно 200 ед. SI нуклеазьь Одну реакционную смесь SI инкубируют при комнатной температуре в течение 5 ми а другую - в течение 10 мин. Реакцию прекращают путем экстракции реакционной смеси насыщенным ТЕ фенолом, экст- ракцией хлороформом и осаждением этано лом. Не подвергнутьй обработке образец ДНК служит в качестве негативного контрольного образца.

Осадок ДНК повторно суспензируют в 20 мкл . 10 мкл полученного раствора используют для трансформации E.coli.

Двунитевую репликативную форму ДНК выделяют примерно из 48 колоний как описано и отбирают на присутствие точки Bam HI (pLUOB). Изоляты .без точки Bam HI отбирают описанным путем получения однонитевой ДНК.

Для построения плазмиды рЫЮС 50 мкг репликативной формы ДНК фага рЫЮВ гидролиз уют в 250 мкл буферного раствора IX Nhe I (50 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,5, 6 мМ М§С12и 6 мМ В-меркаптоэтанол), содержащего л/50 ед. фермента Nhe I при 37 °С в тчение 2 чо Добавляют 5 мкл 5 М NaCl,

,

, |

е

10

20

25

7398563

а затем 5 мкл (50 ед.) фермента Sal I и гидролизуют в течение 2 ч при 37°С. Фрагмент 422 п.о. Nhe I - Sal I, содержащий зону, придающую стойкость тетрациклину, выделяют из акриламидного геля,

ДНК плазмиды рЫЮА гидролизуют ферментами Nhe I - Sal I в аналогичных- условиях, получая Nhe I - Sal I фрагмент размером 6,1 т„п.о„

100 нг каждого из полученных фрагментов сшивают с использованием обыч ной процедуры Плазмида pL110C при- . с дает устойчивость E.coli к тетрациклину, но не имеет точки Bam HI в тет- рациклиновом гене.

Для построения плазмиды pCZRIII сшивают фрагмент/ 3,5 т.п.о. EcoRI - Psс I плазмиды pL110 С (содержащей неповрежденную кодирующую последовательность) с фрагментом размером 3 т.Поо. EcoRI - Pst I плазмиды pIT160. Плазмида содержит фрагмент 3 т.п.о. EcoRI - Pst I, образе - ванный от плазмиды рЫЮС, вставленной в гидролизованную EcoR I - I плазмиду PUC18. Фрагмент содержит ген устойчивости к тетрациклину с той разницей, что точка С1а I исключена Плазмида несет устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина и в ней отсутствует ограничительная точка С1а I. 50 мкг ДНК плазмиды pL110C инкубируют в объеме 250 мкл IX EcoRI раствора, содержащего 10 мкл ( ед,) EcoRI, в течение 2 ч при 37°С. Затем вводят 1 мкл (5 ед„) фермента Rst I и инкубацию продолжают при 37°С. Аликвоты удаляют примерно каждые 5 мин и экстрагируют смесь фенол/СНС Эти аликвоты собирают и смесь подвергают электрофорезу на агарозном геле. Желаемый EcoRI - Pst I фрагмент А/3,5 т„п.о. содержит неподвергнутый воздействию ген bGII и включает внутреннюю точку Pst I. Фрагмент очищают и сшивают с фрагментом Pst I - EcoRI размером 3 т.п.о. плазмиды рГПбО. Полученной 50 ДНК трансформируют E.coli K12 jM 109 и желаемую плазмиду обозначают pCZRIII, характеризуя с помощью известных методик.

30

35

40

45

Для построения плазмиды pCZR336 50 мкг плазмиды рИОЗ инкубируют в 250 мкл высокосолевого буферного раствора IX, содержащего полх50 ед. фермента Bam HI и ХЬа I в течение

33

2 ч при 37°С. Фрагмент 650 п.о ХЬа I - Bam UI, содержащий первый цистерон и ген кодирующей последовательности LGH, отделяют и очищают в акриламидном геле. 50 мкг плазмиды pCZBIII гидролизуют ферментами Xba I и Bam HI и большой фрагмент очищают Фрагменты сшивают друг с другом и трансформируют E.coli K12 RV308, Плазмиду pCZR33S идентифицируют. Построение плазмиды .

1

b -TATGACTTCCAAGCTTCCCGTCTTTCGTCTAGACGACCTCAAGAGCGGCAAGGTCCTCACCGAGCT-S

I I I I М I I I III И I It I 1 Н I И М I И М 1111 I I I I И IН I 1 1 И I I H I HI И I 3 -ACTGAAGGTTCCAAGGGCAGAAAGCAGATCTGCTGGAGTTCTCGCCGTTCCAGGAGTGGC-5

Эта связующая молекула синтезирована в автоматическом синтезаторе ДИК в виде двух одиночных нитей. Молекула имеет несколько изменений; об разование точки Nde I, включающей трансляционную инициирующую точку; замена С на А в третьем положении кодона 10 (лейциновый кодон), поскольку СТС и СТА эквивалентны, образуя точку ХЪа I; замена С на Т в третьем положении четвертого кодона (валиновый кодон), поскольку GTC и GTT эквивалентны.

5 мкг плазмиды pUC 19 растворяют в 50 мкл раствора IX Sst I (50 мМ NaCl, 50 Mil, трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl), содержащего л/10 ед„ фермента Sst I, и инкубируют 2 ч при 37°С Концентрацию NaCl увеличивают до 150 мМ путем добавления 1 мкл 5 М NaCl, добавляют 2 мкл (Ю-ед„) фермента Nde I и инкубируют еще 2 ч при 37°С. ДНК осаждают центрифугироваг нием.,

Примерно 100 нг гидролизованной плазмиды pUCl9 смешивают с 1 пмоль синтезированного связующего звена и Т4-лигазой ДНК. Лигазной смесью - трансформируют клетки Е„со11 К12 JM 109, аликвоты высевают на чашки i с L-агаром, содержащим 100 мкг/мл

ампициллина, 40 мкг/мл Х-gal и

40 мкг/мл IPTG

Чашки инкубируют при 37°С в тече- ние ночи. Колонии, содержащие плаз- миду без вставки, имеют синий цвет, а колонии, которые содержат плазмиду со вставкой, - белыйо Отбирают несколько белых колоний и осуществляют их отбор методом рестрикционного анализа на присутствие фрагмента 60 ПоО. Nde I - Sst I с той же

1739856

34

Плазмида pCZR336 представляет со- бой вектор, несущий промоторflpL. Для соединения DACS/DAOCS с промотором 1( pL в плазмиде pCZR336 необходимо использовать синтезированное связующее звено ДНК. Это связующее звено соединяет точку Nde плазмиды PCZR336 с точкой Sst I в кодирующей последовательности DACS/DAOCS и имеет приведенную структуру:

20

5

0

последовательностью, что и синтезированный фрагмент.

Окончательное построение плазмиды проводят следующим образом.

Плазмиду получают путем сшивки фрагмента Sst I - Ваш HI плазмиды со вставкой Nde I - Sst I плазмиды р 104 и Nde I - Bam HI фрагментом плазмиды pCZR336« Фраг- мент/ч/2,2 т0ПоОо Sst I - Bam HI плазмиды получен путем полного гидролиза Bam HI и частичного гидролиза Sst I. Для этого плазмиду в количестве 50 мкг растворяют в 250 мкл раствора IX Sst I, содержащего 50 ед. Bam HI,и инкубируют при 37°С в течение 2 ч„ Затем вводят 1 мкл (10 ед) фермента Sst I 5 и инкубируют при 37°С.

50 мкг ДНК плазмиды pCZR336 cyc-i пендируют в 250 мкл высокосолевого раствора, содержащего по 50 ед. ферментов Nde I или и выдерживают при 37 С в течение 2 ч«

Фрагмент А/5,8 т.п. о. Nde I - Bam HI плазмиды pCZR336, который не имеет кодирующей последовательности LGU, выделяют из агарозного геля.

100 мкг плазмиды суспензируют в 500 мкл раствора IX Sst I, содержащего 100 ед. фермента Sst I, инкубируют при 37°С в течение 2 ч, концентрацию NaCl увеличивают до . 150 мМ путем добавления 10 мкл 5 М NaCl, вводят 20 мкл (/400 еда) фермента Nde I и инкубируют 2 ч при 37°С. Фрагмент размером /60 п.о очищают в 15%-ном агарозном геле.

100 нг фрагмента Nde I - Bam HI 5,8 т.п.о. плазмиды рСгкЗЗб.ЮО нг фрагмента 2,2 т.п.о. Sst I - Bam HI плазмиды pIT.503 нг фрагмента 60 п.о. Sst I - Nde I плазмиды0

5

0

pit 04 сшивают Т4- пигазой и используют для трансформации клеток Eccoli. Клетки выращивают при 30°С, Трансформанты идентифицируют путем анализа их ДНК.

Приме р 3. Определение продуцированной E.coli активности DACS/ /DAOCS.

Культура E.coli K12 jM 109/pIT507 для выражения активности DACS/DAOCS

Трансформанты E.coli K12 JM109/ выращивают при 30°С в течение ночи в 500 мл питательного бульона (содержащего 10 мкг/мл тетрациклина) в роторном инкубаторе, вращающемся со скоростью 250 об/мин. Клетки разбавляют (1:10) и дополнительно инкубируют в течение 1 ч при 30°С в тех же условиях выращиванияt Температуру воздуха затем повышают до 42°С и инкубацию продолжают дополнительно в течение 6,5 ч Чувствительный к температуре с 1857 flpL-промотор, установленный так, что обеспечивает выражение DACS/DAOCS на плазмиде , инактивируется при 42°С и, таким образом, допускает экспрессию DACS/DAOCS. После инкубации клетки собирают путем центрифу- гирования и используют как предпочтительный источник продуцированной E.coli активности DACS/DAOCS,,

Активность экспандазы и гидрокси- лазы в клетках Eocoli K12 JM109/ , выращенных при

Примерно 14 г клеток Eccoli K12 jM109/pIT507, приготовленных по примеру 3, повторно суспензируют в трис- GEDA растворе (15 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10%-ный глицерин; 10%-ный этанол; 10 мМ дитиотреитол и 10 мМ ас- корбат) в общем объеме 20 мл. Клет- ки разрушают ультразвуком при 4°С. В ходе пропускания звука осуществляют многократный ввод фенилметилсуль- фонилфторида (pMSF) до тех пор, пока окончательная концентрация не достигает 2 мМо Добавляют дезоксирибонуклеазу и сульфат магния до концентрации соответственно 1 мкг/мл и 2 мМ. Суспензию центрифугируют со скоростью 40000 g в течение 30 мин. Поверхностный слой заключает в себе сырой экстракт фермента DACS/DAOCS,,

Этот экстрак,т объемом 13 мл вводят в 50 мл колонку ДЕАЕ-трисакрил, предварительно уравновешенную с 15 мМ трис-GDEA (рН 7,5). Колонку промы0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

вают четырьмя объемами 15 мМ буферного раствора трис-GEDA и затем линейным градиентом от 0,015 мМ трис- GEDA до 0,3 мМ трис-GEDA,, Фракции по 5 мл собирают; фермент элюируется как один основной пик активности,,

Ферментную активность определяют, осуществляя анализ, основанный на жидкостной хроматографии высокого давления Катализированную экспанда- зой реакцию осуществляют в течение 15 мин при 30° С с использованием 0,28 мМ пенициллина N 60 мМсхЈ-кето- глутарата (L-KG), 0,06 мМ сульфата железа (двухвалентного), 0,67 мМ аскорбата, 1,00 мМ дитиотреитола, 0,05 мМ АТР и 0,0008 - 0,008 ед„ фермента в 1 мл 50 мМ трис-HCl (рН 7,5. Катализированная гидроксилазой реакция осуществляется при 36°С в той же среде с DAOC с концентрацией 0,05 мМ вместо пенициллина N.

Реакции останавливают путем добавления 1 мл этилового спирта. Осажденный продукт отделяют центрифугированием при 4000flg в течение 5 мин. Поверхностный слой, содержащий ферментные продукты реакции, анализи- руют методом жидкостной хроматографии высокого давления следующим образом. Активность эксплантазы определяют путем измерения образования как DAOC, так и DAC из пенициллина Н ввиду явной бифункциональности ферментао Активность гидроксилазы определяют путем измерения образования DAC из DAOC.

; Аликвоты (от 20 до 100 мкл) по- .верхностных растворов анализируют на DAOC и DAC посредством жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) с использованием внешних стандартов, DAC и DAOC разделяют с помощью колонки с радиально упакованными спрессованными микроБондпэк NH/j. (0,8x10 см) с подвижной фазой 2% уксусной кислоты, 0,4% метилового спирта, 6-7% ацетонитрила и 87 - 92% воды (рН 5,8)о Скорость потока составляет 1,5 - 2,0 мл/мин, детектирование осуществляют при 260 нм (це- фалоспоринхромофор). Результаты анализа воспроизводимы с 2%-ным отклонением при дубликатных анализах, катализированных как экснандазой, так и гидроксилазой.

П р и м е р 4 мйды .

Построение плазПлазмида (пример 2) содер- жит геномную ,4 п.о., расположенную ниже трансляционной конце- вой точки кодирующей последовательности DACS/DAOCS. Для того, чтобы уменьшить длину этой ДНК все, кроме 120 , удаляют путем использовани ограничительной точки ХЬа I, расположенной ниже трансляционного стоп- кодона в конце кодирующей последовательности DACS/DAOCS„

10 мкг плазмиды расщепляют в 50 мкл раствора IX Sst I, содержащего лМ 0 ед„ ограничительного фермента ХЬа I при 37°С в течение 2 ч.

10 мкг плазмиды суспензируют в 50 мкл раствора IX Sst I с

10ел, каждого(из ферментов Sst Bam HI, и инкубируют в течение 2 ч при 37°С. конец Bam HI дополняют ферментом Кленова.

100 нг фрагмента ХЬа I (дополненного) - Sst I плазмиды смешивают с 100 нг плазмиды , вываренной с Bam HI (дополненного) - Sst I, и трансформируют в K12 jMl 09. Плазмиду идентифицируют методом анализа ограничительного фермента. Плазмида ценна, поскольку слияние дополненных концов ХЬа I и Bam HI, достигаемое при построении плазмиды , реконструирует точку Bam HI (хотя точка ХЬа I разрушается).

50 мкг плазмиды растворяют в 250 мкл высокосолевого раствора ЗХ, содержащего 50 ед. каждого из .ограничительных ферментов Nde I и Ват III, к инкубируют 2 ч при 37°Со Фрагмент л/191 т.п.о. Nde I - Bam HI очищают в акриламидном геле 100 нг фрагмента смешивают с 100 нг большого фрагмента Nde I - Bam HI плазмиды pCZR336, лигируют и трансформируют в E.coli K12 JM109 Трансформанты Е.со11K2 jM109/piI 511 идентифицируют путем анализа ограничительного фер мента их ДНК Клетки Eocoli K12 JM109 могут быть использованы как источни активности DACS/DAOCS согласно про- иедуре, описанной в примере 3.

П р и м е р 5. Построение плазмиды рТГ513,

Кроме мутаций вставки и делеции .аминокислотный состав и последова- тельность генного продукта DACS/DAOC могут быть изменены путем замены основной пары в кодирующей белок зоне.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

Известный способ точечно напра в- ленной мутации описан в примере 2, Представляющий интерес ген сначала клонируют в , создавая под- ходящий источник однонитевой ДНК. 5 мкл М13т18 ДНК инкубируют в 50 мкл раствора IX Sst I, содержащего -10 ед. фермента Bam HI, 2 ч при 37°С„

50 мкг плазмиды инкубируют в 250 мкл буферного раствора IX Sst I, содержащего 50 ед, каждого из ферментов Bam HI и Bgl II, в течение 2 ч при 37°С. ТЪчка Bgl II находится в 5Г-некодирующей зоне выше начального трансляционного кодона кодирующей последовательности DACS/ DAOCS вектора , а точка. Bam HI находится примерно на 100 п,о„ ниже трансляционного стоп-кодона„ Фрагмент ,1 ТоП.о. Bam HI - Bgl II плазмиды очищают обычным разом в акриламиде.

100 нг гидролизованной с Bant HI ДНК фага М13тр18 вводят в 100 нг очищенного фрагмента Bam HI - Bgl II плазмиды Смесь лигируют и трансформируют в Е„соН К12 JM109 Плазмида, полученная в результате желаемой вставки, имеет фрагмент, ориентированный так, что 5 -конец кодирующей последовательности DACS/ /DAOCS (точка BglII) находится около гена lac Z, а 3 -конец данной кодирующей последовательности (точка Bam HI) находится около гена lac I на векторе М13, Соответствующий изо- лят обозначен как mIT113

Синтезируют мутагенную затравку, используемую для данного эксперимента, которая имеет следующую последовательность:,5 -TCGGACTACTOGCACCTACTCCATGGCATC-3

Производное от tnIT113, содержащее указанную последовательность вместо последовательности дикого типа, идентифицировано, охарактеризовано в примере 2 и обозначено как rnIT114. Идентификация желаемого изо- лята облегчается путем создания новой ограничительной точки Alu I

10 мкг ДНК фага mIT114 растворяют в 50 мкл раствора IX, содержащего 10 ед. каждого из ферментов Ват I и Nbe I, инкубируют при 37°С 2 ч. Фрагмент 1,1 топ.о. выделяют в акриламидном геле, смещают с расщепленной Nbe I - Bam HI плазмидой pCZR336, сшивают и трансформируют в Eocoli,

Трансформанты E.coll K12 jM109/pIT51 идентифицируют путем анализа. Плаз- мида приводит к выражению му- тантного производного DACS/DAOCS, которое содержит группу серина, заменяющую группу цистеина в положении 100 в последовательности дикого типа E.coli K12 jM109/p T513, и является предпочтительным источником данного мутантного белка,

П р и м е р 6. Построение мид pPS56 и pPS55c

Плазмида pPS56 представляет собой вектор выражения Cephalosporium acremonium,. который придает устойчивость гидромицину В и содержит ген Cc.acremoni.urii DACS/DAOCS с Плазмида pPS56 построена с использованием плазмиды рМЬС12 (NRR В 18097), плаз- миды (пример 1) и плазмиды pPS34,

Для построения промежуточной плаз- миды pPS55 5 мкг плазмиды pMLClZ растворяют в 5 мкл раствора 1СХ Hind III и 40 мкл воды. В раствор ДИК вводят 5 мкл (50 едЛ фермента. Hind III, инкубируют при 37°С 2ч, экстрагируют фенолом и хлороформом Hind III, гидролизованную ДНК плазмиды pMLC12, осаждают путем доведения концентрации NaCl до 0,25 М и двух объемов холодного этанола, охлаждают при - 70°С в течение 10 мин, центрифугируют и повторно суспензируют в 5 мкл воды о

Фрагмент 2,3 т.п.о. Hind III плазмиды pPS34 содержит промотор синте- тазы изопенициллина N Cephalosporium acremonium, связанный с кодирующей последовательностью гена гидромицина В фосфотрансферазы, который придает устойчивость к гидромицину В

10 мкг плазмиды pPS34 гидролизуют ограничительным ферментом Hind III, разделяют в 0,8%-ном агарозном геле и выделяют 2,3 т.п.о, фрагмент который включает промотор гена Cephalosporium acremonium 1 pS, присоединенный и включенный в рамку устойчивости к гидромицину. 1 мкг фрагмента выделяют и суспензируют в 5 мкл воды 1 мкл гидролизованной G Hind III ДНК плазмиды pMLC12 лигируют с 4 мкл фрамента 2,3 т.п.о. Hind III плазмиды pPS34 и получают плазмиду pPS53.

Клетки выращивают до оптической плотности O.D. 5ф0 0,5, охлаждают на льду 10 мин, центрифугируют. Оса

5

5

0

5

0

док клеток суспензируют в 25 мл холодного 100 мМ СаС1ь, инкубируют на льду 25 мин, центрифугируют, осадок повторно суспензируют в 2,5 мл холодного 100 мМ и инкубируют на льду в течение ночи. 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с ДНК, приготовленной как указано, и инкубируют на льду в течение 20 мин, при 42°С 2 мин и на льду 10 мин. Клетки центрифугируют, суспензируют в 1 мл питательного L бульона и инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

Аликвоты этой клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола, 40 мкг/ /мл X- и 40 мкг/мл IPTG. Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи. Колонии, содержащие плазмиду без вставки, такие как E.coli K12 JM 109/pMLC12, проявляют синий цвет. Колонии, которые содержат плазмиду с вставкой, такие как E.coli K12 jM 109/pPS55, проявляют белый цвет с Из нескольких белых колоний посредством рестрикционного анализа их ДНК плазмиды отбирают кло ны, содержащие фрагмент - 2,3 т.п.о., включающий промотор Cephalosporium acremonium IPS.

Для конечного построения плазмиды pPS56 20 мкг плазмиды рГГЬОЗ гидролизуют ферментом Bam HI и выделяют фрагмент размером 7,0 т.п.о., включающий ген DACS/DAOCSс 15 мкг плазмиды pPS55 гидролизуют ферментом Bam HI и выде- I ляют фрагмент размером 5,0 т.п.о.

Фрагменты лигируют и используют для трансформации E.coli. Идентифицируют несколько плазмид на присутствие фрагмента т.п.о., с од ержаще го ген Cephalosporium acremonium DACS/ /DAOCS, вставленный в подходящую точку Lam HI для образования плазмиды pPSbb.

Пример 7. Построение плазмиды 5 PPSS1.

15 мкг ДНК плазмиды ,С12 гидролизуют ферментом и выделяют фрагмент размером 2,7 т.п.о. Полученный фрагмент гидролизуют ферментом Eco RI и получают четыре фрагмента ДНК: один , фрагмент - желаемая молекула Л/2,7 т. п.о., другой - длиной 24 п.о„; третий - длиной/vO,6 т.п.о., и четвертый - длиной А/1,9 т „п.о.

0

Ацетамидазный ген Aspergillus ni- dulas выделяют в виде ограничительного фрагмента 5,0 т,п.о. EcoRI - Sal I плазмиды p3SR2

с киназсй реакционные смеси инкубируют при 70 С в течение 15 ми зател обе реакционные смеси сливают инкубируют при 65°С 10 мин, а затем при комнатной температуре 2 ч и при 4°С в течение ночи.

Hind III - Hind III фрагмент ДНК плазмиды pPS51, Bam HI - Hind III - плазмиды pIT503 (пример 6); связующ молекулы сшивают Т4 ДНК-лигазой, трансформируют клетки E.coli и получают плазмиду pPS52 путем анализа н присутствие ограничительного фрагмента/4 7, О т.п.оо Bam HI, содержащего ген Cephalosporiutn acremonium DACS/DAOCS, вставленный в точку Hind III, расположенную между генами CAT и amdS плазмиды pPS51«

П р и м е р 9. Построение плазмиды pPS53.

Плазмиду рМЬС12 (NRRL В-18097) гидролизуют ферментом Вага HI. Промотор гена изопенициллин N синтетазы Penicillium chrysogenum выделяют в виде Nco I - Nco I фрагмента (1,0 т.п.о.) плазмиды pLC1°

Синтезируют одиночные нити следующих связующих молекул:

41

Фрагмент размером л/4,3 т.п.о. за лючает ДНК плазмиды pBR322, а фрагмент размером ч 5,0 т.п.о. - ген аце тамидазы (amdS).

Фрагмент EcoRI - Sal I плаэмиды pMLC12 лигируют с фрагментом л/5,0 т п,о. EcoRI - Sal I плазмиды p3SR2 плученной смесью. Трансформируют E.cli.

Идентифицируют колонию на присутствие фрагмента, содержащего ген Aspergillus nidulaus и имеющего точную структуру желаемой плазмиды.

П р и м е р 8. Построение плазмиды рРВ52.

5 мкг ДНК плазмиды pPS51 гидролизуют рестриктазой Hind III,

Синтезируют одиночные нити следующих связующих молекул с использованием автоматического синтезатора ДНК:

5 -GATCCCCGGG-3

ИМИ 3 -GGGCCCTCGA-3r

75 пмоль каждой нити данной свя- зующей молекулы растворяют индивидуально в 22,5 мкл воды и 2,5 мкл раствора лигазы, добавляют 1 мкл (10 ед.) Т4 ДНК-киназы, инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После реакции

856

5

S -CATGAACAAG-S 1

, If|Ml 3 -TTCTTCCTAG-5

Каждую одиночную нить связующей молекулы обрабатывают Т4 ДНК-кинаэой и затем аннелируют с образованием неповрежденной связующей молекулы. 1 мкл гидролизованной Bam HI ДНК плазмиды pMLC12 лигируют с 4 мкл Nco I - Nco I фрагмента плазмиды pLCI и 10 мкл аннелированной связующей молекулы.

Лигазной смесью трансформируют E.coli. Аликвоты трансформированной клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола, 40 мкг/мл X-gal. и 40 мкг/мл IPTG0 Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи. Колонии, которые содержат плазмиду без вставки, такие как E.coli K12 jM 109/ /pMLC12, проявляют синий цвет на

5

этих чашках. Колонииt которые содержат плазмиду с вставкой, такие как E.coli K12 jM 109/pPS53, проявляют белый цвет на этих чашках. Колонии отбирают путем анализа их ДНК на присутствие ограничительного фрагмен- та, содержащего промотор гена изопе-

0 |нициллин N синтетазы Penicillium ichrysogenum (плазмида pPS53) .

Пример 10. Построение плазмиды pPS54.

Ген изапенициллин N синтетазы Ре-

5 nicillium chrysogenum выделяют в виде Hind III - Hind III фрагмента (Л 3,3 т.п.Оо) из плазмиды pLC2. 1 мкл гидролизованной Hind III ДНК плазмиды pPS51 лигируют с 4 мкл ограничитель0 ного фрагмента (3,3 т„п„о.) Hind III

плазмиды pLC2, получая плазмиду pPS54.

Р 11. Построение плаз5

0

5

Приме миды pPS57

Плазмиду pPS55 расщепляют ферментом Bam HI и выделяют фрагмент размером 4,3 т.п.о,, включающий кодирующую последовательность гена HmR.

Bam HI - Bam HI - фрагмент плазмиды pPS53 (размером 1 т.п.о.), содержащий промотор гена изопенициллин N синтетазы Penicillium chrysogenum - лигируют с Bam HI - Ват HI - фрагментом плазмиды pPS55, и трансформируют в E.coli K12 С600 (АТСС 33524). Идентифицируют колонии, которые содержат плазмиды со вставками. Эти плазмиды отбирают путем рестрикцион- ного анализа на присутствие фрагмента л/0,1 т.п.о. Bam HI, включающего промотор гена PeniciIlium chrysoge- nura IpS (плазмида pPS57).

Пример 12. Построение плаз- миды pPS60.

Плазмиду (пример 4) гидро- лизуют ферментом Bgl II и лигируют с фрагментом /И,0 т.п.о. плаэмиды pPS5 (пример 9), трансформируют E.coli К12 0600 (АТСС 33524). Аликво.ты этой трансформированной клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 15 мкг/мл тетрациклина. Чашки инкубируют при 30°С в течение ночи. Колонии, которые содержат плаз- миду без вставки, такие E.coli K12 0600/pIT511 отделены от колоний, которые содержат плазмиду с вставкой, таких как E.coli C600/pPS60, в основном согласно способу Eckardt Идентифицированы колонии на присутствие ограничительного фрагмента, содержащего промотор гена Penicillium chry- sogenum IPS в желаемой ориентации (плазмида рРЬбО).

структуры:

5 -CTAGACACCATGACTTCCAAGGTCCCCGTCTTTCGC-3

3 -TGTGGTACTGAAGGTTCCAGGGGCAGAAAGTGGATC-5

Каждую одиночную нить индивидуально обрабатывают Т4 ДНК-киназой и затем аннелируют с образованием неповрежденной связующей молекулы. Сшитая ДНК составляет желаемую плазмиду pPS59. Ее используют для трансформации E.coli K12 С600 (АТСС 33524), Колонии, которые содержат плазмиду со вставкой, такие E.coli K12 С600/ /pPS59, анализируют на присутствие связующей молекулы.

Пример 15„ Построение плаэмиды pPS61,

ДНК плазмиды pPS51 (пример 8) гидролизуют ферментом Hind III и обрабатывают фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTPS (dATP, TIP, dGTP и dCTP), осаждают, извлекают путем центрифугирования и повторно суспензируют в 5 мкл воды

ДНК плазмиды pPS59 гидролизуют ферментом Bam HI и выделяют фрагмент размером 8,0 т,.ПоОв

Полученный фрагмент плазмиды pPS59 обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы в присутствии четырех dNTpS (dATP, TTP, dGTP и dCTP) и гидролизуют ферментом Nru I, что приводит к образованию двух ограничи

Пример 13. Построение плаз- миды pPS58,

Плазмиду pPS60 гидролизуют ферментом ХЬа I, что приводит к образованию трех фрагментов ДНК; одного фрагмента 7,9 т.п.о. и двух меньших фрагментов ниже 300 п,о. Выделяют фрагмент-v7,9 т.п.о. и примерно 3 мкг фрагмента извлекают и суспензируют в 5 мкл воды. 0,5 мкг этого фрагмента растворяют в 10 мкл буферного раствора лигазы, (4 мкл) Т4 ДНК-лигазы и 86 мкл воды, инкубируя при 15°С в течение ночи. Эта сшитая ДНК составляет плазмиду pPS58, которой трансформируют Eccoli K12 С600 (АТСС 33524). Выявляют колонии TcR, которые анализируют на отсутствие двух небольших фрагментов ХЬа I, характеризующих плазмиду pPS60s

П р и м е р 14. Построение плазми- ды pPS59c

ДНК плазмиды pPS58 гидролизуют ферментом ХЬа I и лигируют с синтезированной одиночной нитью следующей

5

5

тельных фрагментов: фрагмента- 2,1 т.п.о. и фрагмента 5,9 т.п.ос Фрагмент 2,1 т.ПсО. содержит кодирующую последовательность DACS/DAOCS под

контролем промотора гена изопеницил- лин N синтетазы Penicillium chryso- genum и трансляционную активирующую последовательность. Этот фрагмент лигируют. с.фрагментом плазмиды pPS51

для получения плазмиды pPS61,.

Пример 16. Построение плазмиды рР362ь

ДНК плазмиды pPS57 (пример 11) гидролизуют ферментом Hind III, что приводит к образованию одиночного линейного фрагмента 5,3 т.п.о., который обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 в присутствии четы- рех dNTpS (dATP, TTP, dGTP и dCTP). 1 мкл такого фрагмента плазмиды pPS57 вводят в 5 мкл фрагмента л/ 2,1 т.п.о., выделенного из pPS59, как описано в примере 15.

ДНК используют для трансформации. E.coli K12 С600 (АТСС 33524). Идентифицируют колонии, которые содержат плазмиды со вставками, с анализом на присутствие ограничительного фрагмента, содержащего вставку 2,1 т.п.о. (плазмида pPS62).

Пример 17, Генетическая трансформация Penicillium chrysoge- num плазмидами p3SR2, pPS52 и pPS54o

Штаммы Penicillium chrysogenum или любые промышленные штаммы, полученные из штамма АТСС 9480 путем мутации, селекции или генетического размножения с целью улучшенного продуцирования пенициллина G или пени- циллины V, пригодны для использовани при получении трансформантов с векторами и плазмидами, отвечающими предлагаемому изобретению.

Приготовление однородного инокулу ма для клеточной культуры ведут следующим образом.

Для эффективной трансформации клеток Penicillium chrysogenum необходимо удалять стенки клеток с целью образования устойчивых протопластов. При получении таких протопластов желательно начинать с однородного ино- кулюма. В противном случае, получе- ние клеток в культуре будет невоспроизводимым, и будет происходить потеря времени при попытке получить протопласты P.chrysogenum из неподходящих или недостаточных количеств клеток о

Ампулу вегетативных клеток ( Ч 09 о. к. ед. в 1,0 мл предохраняющей среды: лактоза 5%, глицерин 10%, и Твин-80 0,1%) либо лиофилизированных либо взятых из системы хранения в жидком азоте и оттаявших при комнатной температуре, разбавляют в 1,0 мл стерильного солевого раствора. 0,1 мл этой суспензии используют для инокуляции каждого из 10 скошенных агаров среди споруляции, г/л: лактоза 15,0; кукурузньй экстракт 2,5; пептон 5,0; NaCl 4,0; MgS047HaO 0,5; KHZPO«}.0,6; F«Clg;6HeO 0,005; Си804.-5НгО агар 30,0 (рН 7,0) и выдерживают в автоклаве в течение 20 мин при давлении 120 psi (8,4 кг/см2)о

Каждый скошенный агар (,5 см) содержит 25 мл отвержденной среды. Инокулюм, равномерно распределенный по поверхности скошенного агара, выращивают при 25°С до тех пор, пока не .образуются и не спорулируются слившаяся сетка мицелия (для большинства штаммов 1 нед). Продукт выращивают из скошенного агара 1 суспендируют в 10 мл стерильной водной

0

5

0

-среды культивирования, и суспензию переносят в 106 мл водной среды культивирования. Колбу, содержащую суспендированные клетки, помещают в роторный встряхивающий аппарат, и осуществляют инкубацию при 25°С в течение 18 ч при 285 об./мин при вертикальном ходе 25,4 мм.

Водную среду культивирования готовят следующим образом: 100 мл раствора А, г/л: сахароза 36; L-acnapa- гин 7,5; КНгР04 15; K-jHPO 21; 0,75; MgS04-7Hz.O 0,18; СаС12 0,06; солевой раствор 1 мл/л (рН естествен1 ной среды) вводят во встряхиваемую колбу объемом 500 мл. Колбу закрывают и выдерживают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем 2 мл раствора В (глюкоза 108 г/л) и мл раствора С (сахароза 25 г/л; кукурузный экстракт - 4 мас.%/об„азота) - 12,5 мл; ацетат аммония 5,5 г/л; СаСО, 5 г/л; рН доводят до 6,5 посредством КОН; выдерживают в автокла- ве при 121°С в течение 20 мин) вводят в раствор А для получения водной среды культивирования.

Для приготовления протопластов penicilliun клетки от 24-часовой |культуры собирают посредством фильт- рации с всасыванием (бумага Ватмана 1 с использованием воронки Бюхнера) и суспензируют в буферном растворе (0,01 М (оксиметил)аминометан- 5 хлоргидрат; 0,01 М MgS04; 0,01 М ди- тиотреитол; 1,00 М КС1 и рН 7,0 с НС1).

5

0

Вводят достаточное количество буферного раствора до конечной концентрации клеток 1 г клеточной массы на 50 мл буферного раствора. Эту клеточную суспензию помещают во встряхиваемую роторную водяную баню в 250- миллилитровой встряхиваемой колбе и инкубируют при 29 - 30°С в течение 10 мин при 140 об/мин. Обработанные дитиотрейталом клетки центрифугируют, повторно суспензируют в 50 мл фер- ментного раствора (Ю мг/мл Novozym, Novoinduscri А/В Bagsvaerd, Дания): 0,1 М трис(оксиметил)аминометанхлор- гидрат; 0,01 М MgS04, 0,01 М дитио- трентол; 1,00 М КС1 и рН 5,8, во встряхиваемой колбе на 250 мл Эту кислотную суспензию высевают в роторном встряхивателе с водяной баней и инкубируют при 29 - 30 С в течение 15 мин при 140 об./мин с вертикальным

ходом 25,4 мм. Обработанные ферментные клетки центрифугируют при 1240 Xg в течение 6 мин, осадок повторно суспензируют в растворе (0,01 М трис-ок- симетил, 0,01 М MgS04, 1,00 М КС1, рН 7,0). Суспензию центрифугируют при 950 Xg в течение 6 мин, осадок суспензируют в том же буферном растворе, центрифугируют при 700 Xg в течение 6 мин, осадок снова суспендируют в 5 мл того же буферного раствора Суспензия содержит большие протопласты и разрушающиеся при осмосе клетки, которые сохраняют некоторую структуру клеточной стенки. По сравнению с небольшими протопластами, удаленными согласно описанной процедуре, про- цент протопластов, способных к регенерации клеточных стенок, и процент жизнеспособных осмотически стойких клеток выше для крупных протопластов и сомотически разрушаемых клеток в клеточной суспензии. Суспензию клеток разбавляют раствором до концентрации 2х1О8 клс/мл.

Процедура трансформации следующая.

0,1 мл суспензии осмотически разрушенных клеток penicillium chryso- genum (примерно кл.) дополняют 10 мкл 50 мМ СаС1г, 25 мкг ДНК плаз- миды в 5 - 15 мкл буферного раствора ТЕ и 0,9 мл раствора свежерастворенного полиэтиленгликоля 4000. Смесь перемешивают, выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, центрифугируют при 700 Xg в течение 2 мин и снова перемешивают. По 0,5 мл суспензии наносят на поверхность осмотически стойкой стабилизированной ацетамидной среды (1,7 г/л дрожжевого азотистого основания без аминокислот и сульфата аммония; 125 г/л сахарозы, 0,738 г/л ацетамида; 1,27 г/л СаСЦ и 22 г/л агара Noble). Для измерения суммарного количества жизнеспособных клеток, присутствующих в смеси трансформации, аликвоты от этой смеси трансформации высевают в чашки со средой, в которой ацетамид заменен равномолярным количеством сульфата аммония,, Спустя 7 «- 10 дн после трансформации в ацетамидной среде присутствуют колонии трансфер - мантов для пересева. Абортивные трансформанты легко отделяются от стойких трансформантов, поскольку абортивные трансформанты не растут при пересеве в свежеприготовленную

0

5

0

5

ацетамидную среду. Клетки трансформи - руют плазмидой, содержащей ацетами - дазный ген от видимых колоний, через 4 - 5 дн после трансформации,

Анализ трансформант Penicillium chrysogenum/p3SR2, P,. chrysogenum/ /pPS52 и P,chrysogt:num/pPS54.

Трансформанты P°chrysogenim/p3SK2, Pt chrysogenum/pPS52 и Р. chry sogenum/ /pPS54 проявляют активность ацета - мидазы, не обнаруженную в экстрактах нетрансформированного штамма - пиента Р chrysogenum (например, АТСС 9480). Эта активность является ре зультатом способности трансформиро - ванных штаммов расти с использованием аммиака, выделяемого при ацетамидном гидролизе, когда не имеется никако - го другого источника азота. Стойкость трансформантов расти на ацетамиде как единственном источнике азота казьшает функциональность ацетами- дазного гена Aspergillus nidulans в P. chrysogenunu

Трансформирующий фенотип (способ -1 ность расти на ацетамиде как единст венном источнике азота) сохраняется трансформантами после пропускания через неселективную среду

Пример 18С Генетическая трансформация Penicillium chrysoge- num плазмидами pPS55 и pPS57t

Получение протопластов Penicillium chrysogenum осуществляется аналогич-1 но примеру 1 7,

Процедуру трансформации осуществ - ляют по примеру 17с использованием ДНК плазмид pPS55 и pPS57. Клетки, трансформированные плазмидой, содер - 0 жащей гибридный ген HmR, образовьр- вают видимые колонии через 7 - 10 дн после трансформации. Присутствие трифторперизина в хлориде кадмия в основной среде приводит к увеличению 5 чувствительности клеток Ptchrysogenum к гидромицину В,

Анализ трансформантов P.chryso- genum/pPS55 и P.c.hrysogenum/pPS57,

Q P,chrysogenum/pPS55 и Р chrysogenum/ /PS57 проявляет активность гидроми - цин В фосфотрансферазы, не обнаруживаемую в экстрактах нетрансформш- рованного P.chrysogenum (например,

- АТСС 9480)„ Эта активность приводит в результате к способности трансфер - мированных штаммов расти в присутствии токсичных концентраций гидромицина В (с вводом гидромицина В в грибковые

0

5

49

клетки, ускоряемым при экспонирова - нии кадмиевым ионом и трифторперази - ном (TFP). Способность трансформант расти в присутствии токсичных кон центраций гидромицина В (усиленная кадмиевым и TFP) показывает, что гиб ридный ген HmR функционирует в Р„ chrysogenum Более высокие частоты трансформации, получаемые с плазми - Дои pPS57, по сравнению с плазмидой pPS55, показывают, что промотор и 5 г-регуляторные последовательности P. chrysogenum IPS функционируют лучше в P.chrysogenum, чем промотор и 51 -ре- гуляторные последовательности гена Cephalosporium acremonium IPS, сутствунмцего в гибридных генах, торые несет плазмида рР555„

Производные плазмид pPS55 и pPS57 содержащие ген Р chrysogenum, могут использоваться для образования мов с титрами пенициллина V, пре вышающими титр их нетрансформирован -4 ных родителей, благодаря более высо«- кому продуцированию IPS в трансфер - мантах.

Пример 19 о Генетическая трансформация Penicillium chrysogenum с плазмидами pPS62 и pPS61.

Приготовление инокулюма для кле«- точной культуры, приготовление прото гшастов Penicillium chrysogenum и процедуры трансформации для исполы-, зования плазмиды pPS62 или pPS61 для трансформации P.chrysogenum ана«- логичны, описанным в примерах 17 и 18. Плазмида pPS62 содержит ген HmR как селективный маркер, плазмида PPS61 «- ген amdS как селективный мар« кер.

Анализ трансформантов Pochrysoge- num/pPS62 и P.chrysogenum/pPS61.

Стойкие трансформанты P,chrysoge- num/pPS62 и Pochrysogenum pPS61 сут трансформирующую высокомол екуляр ную ДНК о Данный трансформирующий нотип сохраняется после прохождения через неселективную среду

Плазмиды pPS62 и pPS61 содержат гибридный ген DACS/DAOCS, построенный путем сращивания промотора гена P.chrysogenum IPS с кодирующей после довательностью гена Cephalosporium acremonium DACS/DAOCS« Естественный и гибридный гены кодируют синтез как деацетоксицефалоспорин С синтетазы (экспандаза), так и деацетилцефалос«- порин С синтетазы (гидроксилаза).

10

15

20

25

73985650

Активности фермента определяют соот«- ветственно путем катализа пеницилл№- на N до деацетоксицефалоспорина С (экспандазы) и деацетоксицефалоспори - на С до деацетилцефалоспорина С (гид«- роксилазы) о Экстракты трансформантов P.chrysogenum pPS61 и P.chrysogenum pPS62 проявляют активности экспанда - зы и гидроксилазьь Эти активности не обнаружены в экстрактах нетрансфор - мированных штаммов P.chrysogenum. Промотор и трансляционная активирую щая последовательность от гена Р„ chrysogenum IPS, присутствующие в гибридном гене DACS/DAOCS плазмиды pPS61 и pPS62, функционируют в Р. chrysogenum, что позволяет выявить активности экспандазы и гидроксилаз мы

Приме . Генетическая трансформация Cephalosporium acremonium плазмидой pPS56o

Штаммы Cephalosporium или любые коммерческие штаммы, полученные из АТСС 11550 путем мутации, селекции или генетического размножения с целью улучшенного продуцирования i цефалоспорина С пригодны для получе« ния трансформантов векторами и мидами, отвечающими предлагаемому изобретению ,

Получение инокулюма для клеточной культуры ведут следующим образом

Для эффективной трансформации кле ток Cephalosporium acremonium ходимо удалять клеточные стенки для образования стойких протопластов. При приготовлении таких протопластов желательно начинать с однородного инокулюма„ В других случаях приготовь ление клеток в культуре будет невос«- производимым и будет потеряно время при попытке получения протопластов С «acremonium из неподходящих или достаточных количеств клеток,

Для получения однородного инокулнг ма для клеточной культуры ампулу со спорами разбавляют 5 мл стерильного солевого раствора. О,1 мл данной суспензии используют для инокуляции 50 скошенных агаров, содержащих 20 мл среды соевого агара триптиказы (BBL)„ Перед инокулированием среду подвергают высушиванию досуха. Инокулирова- иные скошенные агары инкубируют в

30

35

40

45

50

55

течение 4 дн при 25°С, 10-нл предбх- ранительной среды вводят в среду роста мицелия, которая покрывает поверхность среды в каждом скошенном

э1

агаре. Скошенные агары перемешивают с целью суспензирования конидий. Суспензии конидий от каждого скошенного агара объединяют и 10-миллилитровые аликвоты замораживают при -80°С. Замороженная суспензия конидий медленно теряет жизнеспособность и ее нельзя использовать после 3 мес хранения при -80°Со

Рост клеток для приготовления про топластов ведут следующим образом. 106 мл водной среды в 500-миллилит- ровой встряхиваемой колбе инокули- руют клетками от 10 мл замороженной суспензии конидийо Клетки получают путем центрифугирования (10 мин 2600 об./мин) и суспензирования в вод- ной среде культивации„ До суспензиро- вания необходима декантация поверхностного слоя, поскольку лактоза и глицерин отрицательно влияют на рост клетоКо Колбу, содержащую суспензированные клетки, помещают в роторный встряхиватель с водяной баней и инкуби-i руют при 29-30 С в течение 24 ч при 285 обс/мин с вертикальным ходом 25,4 мм при 29 - 30&Со Необходимо от- метить, что температура 29 « ЗОаС отлична от температуры (25°С), предг- почтительной для культивации Cepha- losporium acremonium для целей дуцирования антибиотика.

Для получения протопластов клетки от 24 -часовой культуры собирают пу тем фильтрации с всасыванием (Бума га Ватмана $1 в воронке Бюхнера) и суспендируют в осмотически стабили -4 зированном буферном растворе (0,8 М NaCl 0,1 М MgS04 и. 10 MM. рН 7,0), в который вводят восставав - ливаюший реагент дитиотрентол до концентрации 0,05 М при конечной концентрации клеток 1 г (после фильтра -1 ции с всасыванием) клеточной массы на 20 мл буферного раствора. Cycnew- зию помещают JB роторный встряхива- тель с водяной баней и инкубируют при 29 г- 30°С в течение 10 мин 2пмер« каптоэтанол при конечной концентрации 40 мМ может быть использован в ка«-. честве восстанавливающего реагента. Обработанные дитиотреитолом клетки собирают путем центрифугирования и повторно суспензируют в растворе (t O мг/мл Novorvm 234 из Novo Bio- labs, Bagsvaerd, Дания; 0,8 М NaCl, Т), 1 М MgSO 10 ИМ и рН 5,8) в 250«-миллилитровой колбе Эрленмейе - ра Конечная концентрация обработан

985652

ной клеточной массы составляет 1 г массы на 10 мл раствора. Клеточную суспензию помещают в роторный встря«- хиватель с водяной баней при 29 «- 30°С на 15 «- 30 мин с Суспензию про«- топластов подвергают вихревому мешиванию в течение 2 «- 3 с для освог- бондения протопластов, пока еще занных с фрагментами мицелия. Эта процедура приводит к образованию терогенной в отношении их размеров популяции протопластов,

Для процедуры трансформации для , каждой плазмиды используют О,1 мл суспензии, содержащей (1 f 5) X 10 протопластов Cephalosporium в 0,8 М

10

15

5

NaCl и 80 М CaClg„ 20 мкг плазмиды и полиэтиленгликоля 4000 вводят по примеру 17 в суспензию протопластов для получения смеси трансформации объемом 1,1 мл, Эту смесь инкубируют в течение 10 мин при комнатной пературе и центрифугируют0 Затем про топласты подвергают вихревому переме шиванию в той же жидкости. Аликвоты (0,1 мл) наносят на поверхность сиказо соевой агаровой среды (BBL), обогащенной 10, сахарозой для осмотической стабилизации протоплас-

0 тов„ После инкубации чашек Петри при 15°С в течение 24 ч в каждую чашку Петри добавляют 4 мл сжиженного агара (0,41 масс%/об. при 42 °С), содержа - щего 0,8 11 NaCl, и гидромицин В до

5 конечной концентрации 100 мкг/мл.

Штаммы С,асгетоп1ит, проявляющие низ«- кую скорость роста в результате мерного мутагенеза, подвергают воз действию пониженного количества гид

0 ромицина в ходе операции отбора (например, конечной концентрации 10 мкл/мл)о После удаления верхнего слоя чашки Петри инкубируют при 25°С в увлажненной камере.

5 Анализ трансформант Cephalospo- rium acretnonium pPS56 проводят дующим образом„

Плазмида pPS56 особенно эффектив - на в отношении вставки множественных

0 копий гена DACS/DAOCS в высокомоле - кулярную ДНК CephalosptDrium acremo- niuni, поскольку она содержит гибрид ный ген HmR, который функционирует как преобладающий маркер в С .асге5 moniura.

Плазмида pPS56 может быть использована для создания штаммов Cepha- 1 osporium acremonium с цефалоспори -1 ном С с титрами более высокими, чем

у нетрансформированных штаммов, за счет копий внехромосомного гена DACS/DAOCSo Копии внехромосомного ге на вызывают более высокие активности DAOCS/DACS, которые способствуют пси вышенному синтезу цефалоспорина, Со Штаммы С асгепюп1шп, продуцирумЬще большие количества цефалоспорина С

и антибиотического продуцирования, так что имеет место лишь влияние вышеиных активностей DAOCS и: DACS на синтез цефалоспорина С.

Трансформанты C.acremonium pPS56 с повышенным продуцированием цефалоспорина С являются ценными продуктами для изготовления клинически важных

- - W- .-,-,- -s.± «4l Vx v f AllM. ПЛ - A UftJl Hnfl «

и значительные количества пенициллина .« цефалоспориновых антибиотиков, таких N, являются ценными родительскими как цефалотиннатрий, цефамандолнафат штаммами для трансформаций с исполь и цефазолиннатрий,

зованием плазмиды pPS56 с целью Формула изобретения лучения трансформантов, которые более Способ конструирования рекомби эффективно превращают пенициллиЪ N t, нантной плазмидной ДНК,.кодирующей в цефалоспорин С Желаемые трансфер - фермент деацетоксицефалоспорин С

синтетазу/деацетшщефалоспорин С синтетазу со следующей аминокислот- , ной последовательностью:

манты Ccacrtsnonium/pPS56 несут транс формирующие ДНК в качестве вставок в нейтральных зонах в отношении роЪта

H2N-MET.THR SER LYS VAL PHO VAL PHE ARC LEU

ASP ASP LEU LYS SER GLY LYS- VAL LEU TIIR GLU LEU ALA GLU ALA VAL THR TIIR LYS GLY ILE PHE TYR LEU THR GLU SER GLY LEU VAL ASP ASP ASP HIS TJIR SER ALA ARC GLU THR CYS VAL ASP PHE PHE LYS ASN GLY SER GLU GLU GLU LYS ARC ALA VAL THR LEU ALA ASP ARC ASN ALA ARC ARC GLY PHE SER ALA LEU GLU TRP GLU SER THR ALA VAL VAL THR GLU THR GLY LYS TYR SER ASP TYR SER THR CYS TYR SER MET GLY ILE GLY GLY ASN LEU PHE PRO ASN ARC GLY PHE GLU ASP VAL TRP GLN ASP TYR . PHE ASP ARC MET TYR GLY ALA ALA LYS ASP VAL ALA ARC ALA VAL LEU ASN SER VAL GLY ALA PRO LEU MA GLY -GLU ASP ILE ASP ASP PHE VAL GLU CYS ASP PRO LEU LEU ARC LEU ARC TYR PHE PRO GLU VAL PRO GLU ASP ARC VAL ALA GLU GLU GLU PRO LEU ARC MET GLY PRO HIS TYR ASP

i

LEU SER THR ILE THR LEU VAL HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY PHE VAL SER LEU GLN CYS GLU VAL ASP GLY GLU PHE VAL ASP LEU PRO TIIR LEU PRO GLY ALA MET VAL VAL PHE CYS GLY ALA VAL GLY THR LEU ALA THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA PRO LYS HIS ARG VAL LYS SER PRO GLY ARC ASP GLN-ARG VAL GLY SER SER ARG THR SER SER VAL PHE PHE LEU ARG PRO LYS PRO ASP PHE SER PHE ASN VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP GLY P.fE ASN VAL ARG ILE PRO SER GLU ARG TliR THR PHE ARG GLU TRP GLY GLY ASN I YR VAL ASN MET ARG ARG ASP LYS PRO ALA ALA ALA GLU ALA ALA VAL PRO ALA ALA ALA PRO VAL SER THR ALA ALA PRO ILE ALA THR-COOH.

заключающийся в том, что осуществляютnium или Penicillium с фрагментом лидирование фрагмента ДНК, кодирующего,55ДНК, кодирующим DAOCS/DACS со сле- 5 регуляторные последовательностидующей нуклеотидной последователь- промотора или гена изопенициллин ностью: N-синтетазы Cephalosporium acremoи антибиотического продуцирования, так что имеет место лишь влияние вышеиных активностей DAOCS и: DACS на синтез цефалоспорина С.

Трансформанты C.acremonium pPS56 с повышенным продуцированием цефалоспорина С являются ценными продуктами для изготовления клинически важных

ПЛ - A UftJl Hnfl «

цефалоспориновых антибиотиков, таких как цефалотиннатрий, цефамандолнафат и цефазолиннатрий,

&

ACT ТСС АЛС- ОТО ССС G-TC TTT CGT СТО,

ОАО СЛС СТО ЛАС ЛСС GGC ЛАС- ОТО СТО АСС GAG СТО GCC GAG- GCC GTC АСС АСС AAG- GGT АТС ТТС TAG ТТО- ЛСС GAG- AGC GЈC СТО G-TC GAC ОАО1

GAC; САС АСС тсс- GCC- CGT GAG ACG TGC GTT GAC ттт ттс AAG мс GGA

АСС GAG- GAG- GAG AAG- ACG GCC GTG ACG- CTC GCCGAC CGT AAC GCC COG

CGC GGC TTC TOT GCC CTC .GAG TGG GAG AGC ЛССGCC GTC GTC ACC GA&

ACG- GGC AAG TAG TCG GAC TAG TOO AGO TGC TAGTOO ATG GGC АТС GGC

GGC AAC CTG .ТГС CCG AAC CGG CCC TTC GAG GACG2C TGG GAG GAC TAG

TTC GAC CGC ATG TAG GGC GCA GCC AAG GAT GTCGC0 CGC GCC GTT CTC

AAC TCT GTG GGC GCC CCG CTC.GCC G€G GAG GACATT GAT GAC TTC GTC

GAG- TGC CAT GCC CTC CTC CGC СТА CGG TAG TTCCCC GAA GTG CCC GAG- GAG CGC GTC GCC GAA GAG GAA CCC C.TC CGC ATG GGA CCC СЛС TAG GAC

t

СТА. TCG-ЛСС АТС ACG CTC GTG GAG GAG AGA.GCC TOG 6CC AAC GOG TTC GTG AGC CTG- GAG TGG GAG G-TG GAC GGA GAA TTC GTC GAC CTC CCG ACG- CTC CCC CCC GCC ATG- GTC CTC TTC TGC GGC GCG GTC GGC ЛСС СТО 0СС ACG-GGC GGC AAG- GTC АЛ6- GCG CCC AAG- GAG CGG GTC AAG TCT CCC GGO CGC GAC СЛ0-.ССС GTC GGC AGC AGC CGC ACG TCG-AGC GTC TTC .TTC CTG- CCC. CCG АЛС CCG GAC TTC AGC TTC АЛС GTG CAG-. GAG TCG AGG- ОАО TGG- GCT TTC AAC GTC CGC АТС CCG TCG GAG CGC AGO. ACG- TTC AGG- ОАО T09- CTT GGC GGG- AAC TAT G-TC AAC ATG CGG- AGG GAT AAG- CCG GCG GCA GCG- CAC. GCG CCT GTC CCC GCG GCT GCC CGT GTC TCT ACC GCA GCT CCT ATA

Г5сЈГАСТ З с фрагментом ДНК, кодирующим 3 -тер-Penicillium chrysogenum или Cephaминальные последовательности генаlosporium acremonium с последующим

изопенициллин N-синтетазы Cephalos-45 отбором клонов, содержащих плазмиды

porium acremoniutn или Penicillium . рТТ507 или PLT511, или PPS58, или

и фрагментом с генетическим марке-pPS359, или pPS60, или pPSol, или

ром Тсг, или amds, или Hmr, трансфор pPS62, или рЦ,502, или pPS52, или

мацию полученными рекомбинантнымиpPS56.

ДНК штаммов Escherichia coli или

Составитель Т.Забойкина Редактор И.ДербакТехред М.Дидык Корректор Л.Патай

/.

Заказ 2013 ТиражПодписное

РЧИИПИ Государственногокомитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

..- ™ ™ ™-вв МИ - . - - (((в - - ГГ -ПГв-в «в 11 П11 ПГ ЯИТИПроизводственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101