Способ получения иммобилизованных гидролаз 0-гликозильных соединений Советский патент 1987 года по МПК C12N11/14 

1.1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения иммобилизованных на гранулированных твердых пористых материалах фе рмен- тов, в том числе к осуществлению процессов активации носителя и связывания ферментов с ним, и может найти применение в микробиологической про- . мышленности при производстве иммобилизованных ферментов, в частности иммобилизованных грибной jb -галакто- зидазы, дрожжевой инвертазы, бактериальных об - и глюкоамилазы и др.

Цель изобретения - увеличение ферментативной активности целевого продукта и ускорение процесса.

Изобретение заключается в том, что .процесс иммобилизации гидролаз 0-гликозильных соединений проводят в перфорированном контейнере. Перфорированный контейнер является конусным сосудом, стенки и дно которого покрыты перфорированным материалом для удерживания гранулированного носителя и не создающего заметного гид I

равлического сопротивления при движении растворов через слой гранул, В ходе рециркуляции растворов обра- зуётся на поверхности слоя гранул слой жидкого реагента, высота которого зависит от скорости притока реагента. За счет действия капиллярных сил и водопроницаемости упакованного в контейнере пористого материала, .жидкие реагенты контактируют с носителем,более эффективно, По своим техническим показателям контейнер приближается к реактору с фильтрующим дном, однако в перфорированном контейнере активно работают также стенки, которые способствуют эффективному перемещению жидкости в межгранульном пространстве. Эффективность движения жидкости в перфорированном контейнере можно сравнивать с перемешиванием в реакторе. Таким образом, контейнерный метод иммобилизации на гранулированные материалы ферментов имеет следующие преимущества: увеличивается эффективность и интенсивность контактирования реагентов ,с носителем, которые отражаются в увеличении активности препаратов и сокращении времени проведения процесса, а также уменьшаются потери носителя за счет отсутствия его механического разрушения, имеющего место в реакторах перемешивания.

42

в том числе в дражирователе, В nejv ({юрированном контейнере упакованный носитель не требует многократной пе-. регрузки в ходе многоэтапной иммобилизации.

Использование душевого устройства позволяет создавать равномерный слой реагента по всей поверхности носителя и обеспечивает рециркуляцию pea-

гентов с нужной скоростью.

Ускорение процесса иммобилизации с сохранением высокой активности целевого продукта может быть достигнуто при заполнении контейнера слоем

пористого кремнезема толщиной 40- 220 мм и пропускании реагентов со скоростью 40-220 л/мин на 1 м в течение 0,1 - 2,0 ч (при расходе реагентов 1,0 - 5,0 г на 1 кг носителя).

По сравнению с известным способом достигается уменьшение времени процесса иммобилизации на 1 ч, а также увеличение активностей иммобилизованных ферментов в 8-200 раз,

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Примеры 1-3, В перфорированные контейнеры (размеры и другие

данные указаны табл,1) загружают

0,45 кг (пример 1), 1,0 кг (пример 2) или 2,4 кг (пример 3) сухого силика- геля С-80 с размерами частиц 0,3- 0,5 мм, диаметром пор 40-60 нм и

удельной поверхностью 80 . Высота слоя гранул 75 мм, 125 мм или 180 мм соответственно. Через слой гранул пропускают 0,1 М ацетатного буфера рН 4,6 для пропитывания пор

гранул буфером. Затем пропускают 0,9 л, 2,2 л или 5,5 л ферментного раствора, имеющего исходную активность 175 Е/мл со скоростью рециркуляции 4,0 л/мин. За единицу активности /3- галактозидазы принято такое количество фермента, которое образует в 5%-ном растворе лактозы 1 мкмоль продуктов за 1 мин при рН 4,6 и 30°С.

Кинетика адсорбции -галактозидазы на силикагель С-80 представле- на в табл.1, откуда видно, что она практически заканчивается за 30 мин. После контактирования фермента с

носителем полученный комплекс обрабатывается 1%-ным водньм раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,85, При скорости рециркуляции 4,0 л/мин процесс про313

должается 45 мин, Объемное соотношение реагента и влажного носителя 1,5 л/кг. Иммобилизованная /3 -галак- тозидаза очищается от следов реагента и фермента, которые не принимают участие в. реакции, проточной промывной водой со скоростью 3 л/мин в течение 15 мин, а затем рециркуляци- ей со скоростью 3 л/мии 2М раствором NaCl в течение 15 мин. Объемное соотношение промьшного реагента и носителя 2,1 л/кг сухого материала. Затем повторяют проточную промывку водой. Для увеличения срока.хранения препарата его пропитывают 0,1 М ацетатным . буфером рН 4,6. Получают 2,2 кг, 5,6 кг или 8,0 кг влажной иммобилизованной / -галактозидазы с активностью (Е-г сухого) и выходом (%): 253 Е/г (65,5%); 265 Е/г (66,0% или 245 Е/г (65%) соответственно. Общая продолжительность процесса иммобилизации 3,0 ч. Если проводить адсорбцию в течение 0,5 ч, то процесс продолжается 2 ч, т.е. в сутки можно изготовлять не менее 22-80 кг готовой иммобилизованной и -галактозидазы .

Пример 4.В перфорированный контейнер (пример 1) помещают 560 г сухого силикагеля МСА-750 (размер частиц 0,6 - 0,6 мм) . Высота слоя гранул 80 мм. Через слой пропускают со скоростью 4,0 л/мин или 220 л/мин на 1 м сечения контейнера 5%-ный водньй раствор аминопропилтриэтокси- силана в течение 30 мин. Объемный расход силана 3,6 л/кг носителя. За .ходом процесса следят по исчезновению в реагенте основного вещества - силана. Концентрация силана определяется титрованием проб 0,1 М НС, Изменение концентрации силана в рабочем реагенте в ходе силинизации силикагеля МСА-750 представлено в табл,2.

Расчетное количество связанного С носителем силана найдено из материального баланса по остаточной кон цент рации силана.

После термической обработки гранул при 120°С в течение 2,0 ч проводят активацию носителя с помощью 1%-ного глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН.6,85 в течение 30 мин при расходе реагента 2,2 л/к носителя. Скорость рециркуляции реагента 105 л/мин I м сечения или

44

2,0 л/мин. Проточная промывка водой осуществляется в течение 10 мин со скоростью 2,0 л/мин, а обработка 0,1 М ацетатным буфером рН 4,5 в те- чение IО мин при расходе буфера

2,0 л/кг носителя. Определяемое количество активного альдегида на но- сителе 0,205 мг-экв/г.

Иммобилизации подвергается гриб- ная jb -галактозидаза с исходной активностью 56 Е/мл, Скорость рециркуляции фермента 220 л/мин 1.м сечения при расходе реагента 3,6 л/кг.носителя . Данные по иммобилизации /Ь - галактозидазы в слое силикагеля МСА- 750 приведены в табл,3.

Непрореагировавший с носителем фермент удаляют проточной промывкой водой при скорости 110 л/мин на 1 м .сечения в течение 10 мин, затем 1 М раствором NaCl в тех же условиях,

Активность препарата 40 Е/г, т,е, 52,3% от взятой для иммобилизации активности. Получают 1,8 кг готово- го продукта в течение 5,4 ч, т,е, 9,0 кг в сутки.

Пример 5.В перфорированный контейнер (пример 3) помещают слоем толщиной 200 мм 2,6 кг сухого сили- кагеля С-80. Рабочая поверхность 0,06 м. Силанизация проводится 1%-ным водным раствором аминопропил- триэтоксисиланом в течение 30 мин

при расходе реагента 4,3 л/кг носи- теля и при скорости рециркуляции 55 л/мин-м. Термическая обработка при 120 с, обработка 1%-ным раство-.: ром глутарового альдегида, а также

удаление нереагировавших остатков ре- агентов осуществляется так, как описано в примере 4, но с удельной скоростью реагентов 60 л/мин-м ,

Для иммобилизации применяют препарат |5 -галактозидазы. с исходной активностью 140 Е/мл, Скорость циркуляции при расходе ферментного раствора 2,8 л/кг носителя 3,9 л/мин, .т,е, 65 л/мин,м. Данные, иллюстрирующие ход иммобилизаций -галакто- зидазы в слое силикагеля С-80, приведены в табл.4.

Из данных табл,4 видно, что хотя процесс проводят в течение 6 ч, он практически заканчивается уже после 30-минутной рециркуляции ферментного раствора.

Помывка полученного препарата осуществляется по технологии, описанной в примере 4,

513

Получено 8,2 кг иммобилизованной -галактозидазы с активностью Г45Е/Г ( за 3,4 ч), что позволяет прорзво- ить 57,4 кг препарата в сутки,

Пример 6-9, В перфорированый контейнер (пример 2) помещают 10 кг сухого силохрома (.размеры час-, тиц 0,3 0,5 мм). Высота слоя 135мм, рабочая поверхность гранул 0,05 м, ерез слой гранул пропускают со скоостью 5 л/мин т,е, 100 л/мин на 1 м, 1.%-ный водного раствора аминпропил- триэтоксисилана в течение 0,5-ч. Терическая обработка проводится, как описано в примере 4,

Активация силанизированного носителя осуществляется раствором бензохинона в этаноле в течение 30 мин при скорости рециркуляции 120 л/мин м , Расход реагента 4,0 л/кг носителя.

Промывка и подготовка для иммобилизации носителя пров однтся так,, как описано в примере 4,

Для получения иммобилизованной ин- вертазы применяют препарат, полученный экстрагированием отработанных в пивоварении и измельченных пивных дрожжей. Активность в Е/мл,, т.е. в мкмолях продуктов реакции гидролиза, которые образ- аотся в течение 1 мин при рН 4,6 и температуре 30 С,

Данные иммобилизации в различных условиях инвертазы, полученной из пивных дрожжей, приведены в табл.Б,

. Получают 3,0 кг готовой инвертазы в течение 3,9 ч, т„е, 31,2 кг в течение суток.

Пример 10, иммобилизацию инвертазы проводят так., как описано в примере 7, но в качестве ферментного препарата применяют водный раствор инвертазы марки А (НПО Виохимре- актив) в О , 1 М ацетатном буфере рН 4,6 с активностью 7200 Е/мл, Лктид- ность полученного фермента инверта-- зы 2050 Е/г сухого, Выход активности 42,3%.

Пример 11, ля гголучения иммобилизованного ферментп, обладаю™ щего глюкоамилазной активностью, носитель силохрома СХ-2 активируют так как описано и примере 7, но в качестве фермента применяют раствор гл1око амилазы L-150 фирмы Ново (Дания) с активностью 2380 Е-мл, За единицы активности принято такое количес во

70246

фермента, которое в растворе растворимого крахмала катализирует его гидролиз при рН 4,6 -и 50° с образованием 1 мкмоль глюкозы в 1 мин,

5 Активность иммобилизированной 990 Е/г, с выходом 29,3%,

П р и м е р . 12. Для получения шчмобилизованного фермента, обладающего oi -амилазной активностью,

JO подготовку носителя и процесс иммо- .билизации проводят так, как в примере 11, но в качестве фермента применяют раствор об -амилазы фирмы Ново под фирменным названием Bacterial

15 Anylase 120L, Перед применением фер- ментньй препарат разводят в 10 раз 0,1 М фосфатным буфером рН 2,6, Активность фермента выражают в микромолях мальтозы (li) , образовавшейся

0 в течение мин под действием 1 г катализатора в 1%-ком растворе крахмала при 50°,и рН 6,2, Активность ис ходного фермента 2520 Е/мл, а иммобилизованной -амилазы 720 Е/г,

25 (выход 37,2%).

Пример 13, В перфорированный контейнер высотой 100 мм и размером 80 и 290 мм,; зах ружают 1 ,2 кг сухого силикагеля С-80, Высота слоя

.30 40 мм, Технологический процесс иммобилизации р -галактозндазы осуществляют, как оаисано в примерах 1-3, Ак- тивнсЗсть полученного препарата 240.Е/Г при выходе активности 60,8%., кбличе35 ство получаемого препарата 3,8 кг.

Бремя проведения технологических one- раций 3 ч, Общая производительность 30,4 кг в сутки,

Q Объемный расход каждого компонента колеблется в пределах 1,0-5,О л/кг носителя и определяется минимальным и максимальн 21М необходимым количеств вон основного вещест)ча в реагентах,

(5 которые мот ут обеспечивать или более не увеличивают положительного эффекта. Расход реагента регулируется в соответствии с изменением конпент рации реагента и зависит от рода ре/J-Q агента, от его химических свойств, от нос:-ггеля и т.д,

Нилчлим Пределом скорости рециркуляции реаг ентов является минимальное контактное время и кратность рецир- 55 КУ-1 ИИ, в течение которых намеченный технологичес;кий процесс завершается достижением цели, например ак тивности иммобилизованного фермента, Верхним пределом скорости является

максимальное контактное время и кратность рециркуляции. Удельные предельные скорости учитывают величину сечения контейнера, а также общее количество гранул в контейнере.

В качестве носителя находят применение крупнопористые, с развитной поверхностью гранулированные материалы типа силикагеля (МСА-750, С-80) или силохрома (СХ), а также другие, имеющие размеры частиц 0,1 - 1,0 мм.

Высота слоя гранулированного носителя в контейнере определяется его свойствами. Главными параметрами являются гранулометрический состав, размеры гранул, пористость и другие показатели, обеспечивающие скорость самотока реагентов в пределах 2 - 5 л/мин, т.е. 40-220 л/мин на 1 м сечения слоя гранул. Увеличение высоты слоя (выше 220 мм) нецелесообразно из-за уменьшения скорости самотока, а увеличение ее можно осуществить лишь с помощью внешних сил (давление в закрытой системе, центрифугальная сила и др.). Уменьшение высоты слоя (менее 40 мм) приводит к уменьшению производительности способа и исчезновению капиллярного эффекта дви

Диаметры контейнера, Mi j

0

5

5

жения жидкости в пространстве пористого гранулированного слоя.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет увеличить активность иммобилизованных ферментов (в 8-25 раз для -галактози- дазы и в 150-200 раз для инвертазы . в расчете на 2 носителя), а также, ускорить процесс иммобилизации. Формула изобретения

Способ получения .иммобилнзов.анных гидролаз 0-гликозильных соединений, предусматривающий обработку пористого кремнезема химическими реагентами, водным раствором фермента и промывание носителя водными растворами в проточном контейнере, отличающийся тем, что, с целью увеличения ферментативной активности целевого продукта и ускорения процесса, обработку химическими реагентами и раствором фермента, а также промывание проводят в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной слоя 40 - 220 мм, душированием в течение 0,1- 2,0 ч со скоростью 40-220 л/мин на 1 м при объемном расходе реагентов 1,0 - 5,0 л на 1 кг носителя,

Т .а б л и ц а 1

90/150 155/260 180/290

Активностьраствора, Е/мл

56,0 50,0 49,2 49,0 46,8 45,8

Время иммобилизации, мин

Активность иммобилизованного фермента после (промывки Е/г: 145

Выход, % 50

Расчетное количество связанного - фермента, Е/г

О

42,8

48,6

50,0

65,6

78,8

Таблица 4

Остаточная активность раствора

Е/г

I

%

Редактор И, Сегляник

Составитель В. Муронец Техред М.Ходанич Корректор Л, Патай

Заказ 2394/23 .Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного, комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., -д.Л/З

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения иммобилизованных на твердых носителях ферментов. Цель изобретения - увеличение ферментативной активности иммобилизованных гидролаз и ускорение процесса. Иммобилизацию осуществляют в перфорированном контейнере, заполненном пористым кремнеземом с толщиной слоя гранул 40-200 мм. Реагенты направляют рециркуляцией душирова- нием через слой. Скорость рециркуляции реагентов 40-220 л/мин на 1. м сечения. При расходе реагентов 1-5 л на 1 кг носителя отдельные процессы активации и иммобилизации осуществляют в течение 0,1-2,0 ч. Данным способом иммобилизованы грибная р -га- лактозидаза, дрожжевая инвертаза и другие гидролазы. 5 табл. i СЛ со