Способ получения иммобилизованных ферментов Советский патент 1980 года по МПК A61K38/43 

1

Изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к способу получения иммобилизованных ферментов, которые сохраняют общие 5 свойства ферментов и могут быть использованы в качестве гетерогенных катализаторов в реакциях превращения органических соединений и биохимических препаратов как в периодическом, Ю так и непрерывном процессе катализа, в химической, микробиологической, медицинской и пищевой промышленности.

Известные в настоящее время способы получения иммобилизованных фер- .с ментов методами ковалентногр связывания ферментного белка На водонерастворим|1е носители основывеиотся аа применении бифункциональных реагентов, которые способны реагировать с -Q водонерастворимым носителем и с ферментным белком 1. Общим недостатком большинства известных способов можно считать относительно низкую термическую стабильность получаемых 25 препаратов.

Известен также способ получения иммобилизованных ферментов посредством ковалентного связывания ферментов с водонерастворимыми носителями, -Q

Ьктивированньми бифункциональным реагентом - 1.,4-бензохиноном 2. Согласно известному способу иммобилизованные ферменты (например, трипоин,

пеницшшинамидаза) или другие протеины получают путем ковалентного связывания их с полисахаридньши носителями при помощи 1,4-бензохинона или

1,2-нафтох;инона. Гели (например, An-Sepharose 4В) подвергают инкубации при перемешивании в фосфатном буфере (рН 7,4) в,присутствии 1,4-бенisoxHHOHa при комнатной температуре в течение 20 ч. После удале 1ИЙ непро реагировавшего бензохинона промыванйем геля добавляют фермент и проводят реакцию при С в течение 24 ч. Иммобилизованный фермент промыйайт многократно буфером, а затем 1 М раствором хлористого натрия. Отмечается, что активность препарата сохраняется при температуре 4 С в течение 3 месяцев.

Этот cnocq6 прост. Однако в этом способе не устраняется указанньий : недостаток, присущий другим известным способам иммобилизации, а именно низкая термостабильность получаемых прв. наратов. . Целью изобретения является увели ченйетёрйостабилЁйоётй препаратов щмобилиэованных ферментов. Указанная цель достигается за сче того, что иммобилизованные ферменты дапоЛнительно обрабатывают глутаровым альдегидом в количестве 0,5 - 4-40 с 3 Mft/экв, на 1 г носителя при в течение 1-24 ч. Согласно изобретению описывается способ получения иммобилизованных ферментов с повышенной стабильностью Орепаратов путём ковалентного связыШаяйя ферментов с водонерастворимыми носителями, предварительно активированными 1,4-бвнзоз4йноном, с послёдую вдрй обрабрткой Препаратов глутаровым альдегидом в количестве 0,5-3 на 1 г носителя при втечение 1-24 ч. - - -- Реакдан связывания ферйента с 1,4 -бензо синоном Осуществляется через аминогруппы белка и носителя. С цель увёлйчания количества аминогрупп на йосйтёлё его можно предварительно об рабатывать З-амийопропилтрйэтЬКСйсиланом. После нуйлеофйльного присоеди нения Г, 4-бенэохинона носителем и ферментным белком на поверхности но.йителя образуется оболочка изфермен ного белка, которая вследствие дйссо tftiaiiHH легко удаля1ется и тем самим уменьшает стабильность иммобилизован ного фермейта После реакции свободных остатков аминогрупп с такой оболочкой обра3 уют с я прочные дополн ит ель ные связи йёящу отйельными молекулами ферментного белка и глутарового альдегида. Тайим образом, образуется препарат иммрЬилйЭЪванного фёр1мейта, который обладает более высокой термической стабильностью. Следовательно, сочетание йвух самостоятельно п отё1гШгдйх реакций в присутствий реакционно спосрбных бифункциональных реагентов приводит к повышению доли стабильной фракции иммобилизованного фермента в препарате от 30 до 55%, а скорость Термической инактивации стабильйой фракции фер5иента уменьшается в 4 раза при температуре 70с. При м е р 1. Взвешивают 10 г силанизированного 3-аминопропилтриэтоксйланбм силохрома СХ-2 с размерами частиц 0,25-0,5 мм и содержанием активйых аминогрупп на поверх нрсти носителя 190 мл-экв/г. Добав.ляк5т 1,5 г кристаллического 1,4-бен4зохинона и 40 МП технического зтанола. После контактирования суспензии в течение 1 ч при комнатной температуре полученный продукт промывают техническим зтанолом до полного исчезновения темно-коричневого цвета в промывных водах (всего 500 мл/г), а затем дистиллированной водой (всего 200 мл/г) для удаления следов зтанола. Получают 22,3 г влажного материала. Длд проведения иммобилизации пенициллинамидазы 10 г материала смешивают с 50 мл ферментного раствора с пенициллинамидазной активностью 20000 Е/мл. За единицу де)ствия пенициллийамидазы принято такое ее количество, которое гидролизует К-соль бензилпенициллина в 17 мл раствора при и рН 7,0 в присутствии 0,1 М КС6 с образованием одного мкмоль фенилуксусной кислоты в 1 ч. После инкубации смеси при комнатной температуре в течение 10 ч готовый материал промывали сначала дистиллиройанной водой (всего 1000 мл), а затем 1 М раствором НаСЙ для удаления нёпрореагировавшего фермента. Получают 9,9 г иммобилизованной , пенициллйнамидазы, которая обладает активностью 5200 Е/г сухого препарата. Для увеличения стабильности полученного препарата его обрабатывшот при помощи водного раствора глутарового альдегида: на 8,5 г иммобилизованной пенициллинамидазы добавляют 90 мл 0,1 м фосфатного буфера рН 7,0 и 10 мл раствора глутарового альдегида (1,5 мл.экв. на 1 г влажного материала). СмеСь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. После обработки препарат промывают для удаления следов глутарового альдегида дистиллированной водой- (всего 500 мл). . Для определения стабильности препарата инкубируют его при температуре 40с в 0,1 М фосфатномбуфере (рН 7,5), в течение 800-1000 ч. Скорость термической инактивации иммобилизованной пенициллинамидазы равняется 0,000333 ч . Сравнительные данные по стабильности препаратов пенициллинамидазы, обработанной глутаровым альдегидом и без него, приведены в табл. 1.

Стабильность препаратов иммобилизованной пенициллииамидазы, полученной ковалентным связьшанием фермента 1,2-бензохиноном и обработанных глутаровым альдегидом и без него

,Табл

Таким образом, применение глутарового альдегида приводит к увеличению работоспособности иммобилИзоваиной пенициллинамидазы (активность не ниже 3000 Е/г) не меньше, чем в 3 4 раза. Пример 2. Получение активйрованного носителя осуществляют так же, как описано в примере 1. С целью получения препарата с - галактозидаз ной активностью составляют смесь из фермента и носителя (5 мл ферментного раствора активностью 48 Е/мл на 1 г носителя). После инкубации в течение 5 ч при комнатной температуре гранулы промывают 0,1 М ацетатным буфером рН 4,5 и 1 М раствором NaC6. Получают препарат с активностью 201,8 Е/г сухого материала. За единицу действия р-галактозида зы принято такое ее количество, кото рое осуществляет гидролиз синтетичес кого субстрата О-нитрофенил-fV-D-raлактопиранозида при температуре в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,2 с образованием мкмоль О-нитрофен6ла в течение 1 мин. Обработку глутаровум альдегидом проводят, как описано в Условия проведения о пенициллинамидазы глу и стабильность пол

1,17

1,50 0,77 0,64

22 22

900

3,33 3,7-5 800 примере 1. Применяют 0,24 мл 25%-но-, ГО раствора глутарового альдегида на 1 г сухого носителя в 10 мл дистиллированной вода. Обработка продолжает;ся в течение 2,5 ч. готовый арепаратг. промыва;йт 0,1 М ацетатным буфером ;РН 4,5, . Термостабильность имйобйли зованной ji-галактозидазы изучают Инкубированием препарата в 5%-ном растворе лактозы {рН .4,5) при температуре 70°С в течение 180 мин. Установлено, что препарат инак йвируется в две (Стадии: за первой стадией (т.н. нестабильная фракция фермента, всего 42%) , следует вторая стадия с iстабильной фракцией фермента (58%). Скорость инактивации ста- бильной фракции фермента 0,0095 мин. Примеры З-б. Эти примеры описывают обработку глутаровым альдегидом препаратов иммобилизованной пенициллинамидазы в различных условиях. ; Условия проведения обработки и результаты по стабильности препаратов приведены в табл. 2. IT а .6 л и ц а 2 тки иммобилизованной зым альдегидом ных препаратов

Ста бильность определяют после инкубации препарата в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,5 и температуре 4(fc. П РИМ е р 7, Получают активиро ваиннй 1,4 бенэохиноном носитель еле дующим образом. Взвешивают 10 г силохрома СХ-2 с рйэмерами частиц 0,25-0,5 мм,добавляют 20 мл дистиллированной воды и 1,0 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана {ссэДержание аминогрупп в силане 3800 мк-экв/ип) перемешивают и остав ляют при комнатной температуре. Чераэ 3 ч гранулы фильтруют и нагреваю при температуре 120С в течение 1 ч. 1Транулы промывают многократно (5 раз по 300 мл дистиллированной водой) до исчезновения в промывных водах следов снлана (обнаруживают хиноном). С«адержа:ние активных аминогрупп на по вёрхнрсти носителя 180 м(экв/гсухогоматериала. На 10 г обработамйого сйланом силохрома добавляют 1,5 г кристалличес кого 1/4-бе1Нзохинона и 40 мл техничебкого этанола. После контактирования суспензий в течение 1 i при ком 1атной температуре полученный темнокоричневый продукт промывают 1Рёхническим этанолом, дистиллированной водой и 0,05 М ацетатным буфером рН 4,7. ;. - -..:-; . . .г..:.--. - Для получения имйобилизовйнвой инвертазы применяют дрожкёву о йнвертазу марки А Олайнеского завода химреактивов. 7,5 г порошка инвертазы растворяют в 50 мл 0,05 М ацетатного буфера рН 4,7, активность 15400 Е/мл (всего 770000 Е). Активность инвертазы выражают в микромолях сахарозы,которая расщепляется пр действии фермента в 7%-ном растворе сахарозы в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7 при температуре 40с. 50 МЛ раствора инвертазы приливают к 50 г гранул влажного активированного силохрома. Полученную суспензию (после

Продолжение табл.2 тщательного перемешивания) оставляют в xoJ: oдильникё. Реакция носителя с фермен том проДОлжает ся 17,5 ч,фильт рацией удаляют 48 мл ферментного pacTBOiia с активностью 3120 (вce го 149760 Ё, 19,4%).Препарат иммобилизованной инвертазы промывают ацетатным буфером (т.е. удаляют еще ч 81000 Е, 10,5%) и дополнительно 1 М раствором КСЙ (т.е. удаляют еще ISSOO Е, 2,2%) . Активнос-гь препарата иммобилизованной инвертазы - 4500 Е/г влажного носителя (всего 225000 Е, 29,2%). :: Для увеличения стабИ7 ьности полученного препарата его обрабатывают при помощи водного раствора глутарового альдегида} на 50 г икмобилизованной инвертазы добавляют 480 мл 0,05 М ацетатного буфера рН 4,7 и 20 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида (0,5 мл-экв. на 1 г влажного материала), Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. После обработки препарат npoNHвают для удаления следов глутарового альдегида 0,05 М а1 етатным буфером. Активность полученного npenajpaTa 4430 Е/г (всего 221500 Е, 28,8%). Для проверки работоспособности данного препарата 49,8 г гранул им-. мобилизованной инвертазы помещают в терморегулируемую при колонку, а через нее пропускают раствор сахарозы с концентрацией 700 мг/мл со скоростью 14 мл/мин. Содержание редуцирующих Сахаров в продукте 690 мг/мл, степень конверсии 98,6%. Сравнителйные данные по термостабильности препаратов иммобилизованной инвертазы, обработанной глутаровым альдегидом и без него, приведены в табл. 3.

Стабильность препарйтЬв иммобилизованной йнве полученной ковалентным связыванием фермента с 1,4-бензохиноном и обработанной глутаровым альдегидом и без него (стабильность определяют хранением препаратов при в 0,05 М ацетатном буфере рй 4,7)

Время полужйзни иммобилизованной инвертазы равняется для препарата, обработанного глутаровым альдегидом и без него, 160 и 86 мин соответственно. .Скорость тёрМоинактивации препарата увеличивается до 2 раз-.

Пример 8. Получение активированного нрсйфеля для иммобилизаций глюкоамилазы ;осу1Цёс вляют так же, как опирано в примере 7. В рабрте применяют- глюкЬайилазуфйрМы Ново (Да.ния) Из Asp. hlgeг активностью i500 Е/мл и с содержанием белка 300 мг/мл. Активность фермента выра жается по способности образовывать из О,5%-ного растворимого крахмала в течение 1 мин при температуре 20 С и рН 4,7 (0,05 М ацетатный буфер) ;1 мкмоль глюкоаы. Концентрацию белка определяют по поглощению фёрМентнЪго раствора, при 280 им.

На 11,6 г активированного силанрм и 1,4-бензЬхиноном силохрома добав ляют 25 мл ферментного раствора глюкоамилазы с активностью 500 Е/мП (всего 12500 .Е) и конт актируют суспензию в течение 114 ч при комнатной температуре. Маточный раствор содержит после реакции белка 117,5 мг/мл (всего 2938; мг, 39,2%) и имеет активность 480 1:/мл (всего 12000 Ё, 96%) . Препарат иммобилизованной глюкрамилазы имеет активность по 0,5% крахмалу 3093 Е/г влажного препарата.

ТаблицаЗ

Для увеличения стабильности полученного препарата его ое5рабатывают при помощи водного раствора глутарового альдегида; на 11,0 г иммобилизованной глюкоамил азы дрб авЛяйт 91 Мл 0,05 М ацетатйого буфера рН 4,7 и 8,6 мл 25%-ногр раствора гЛутарозэого альдётйда (1,0 мл.-экв. на 1 г йЛаж-/ ного матё риала) . Смесь выдерживешт при комнатной тем11ератУ1 ё в течение 3 ч. После обработки прёпйрат ttfiotsaвают 0,05 М а1цетатным буфером для удаления с Ледов глу т apoBplO альдегида. Активность полученного препарата 30,2 Е/г.

Для проверки работоспособности иммобилизованной глюкоамилазы i О 94 г препарата помещают в термостатируемый реактор с перемешиванием и добавляют 35%-ный раствор мальтодекстрииа (фирма Майзен, исходный|декстрозньай эквивалент 17,5) s 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7. Гидролиз мальтодекстрина проводят при температуре . После id мин гидролиза содержание редуцир5 щих Сахаров (охфеделяемых по Бёрнфельду динитросалициловой кислотой) 50 мг/мл, через 40 мин - 240 мг/мл,120 мин 280 мг/мл.

Сравнительные данные по термостабильности препарата иммобилизоваиной глюкоамилазы, обработанной глутаровьм альдегидом и без него, приведены в табл. 4.

NТаблица4

Стабильность препаратов иммобилизованной глюкоамилазы, полученной ковалентным связыванием с -бенэохиноном и обработанной глутаровым альдегидом и без него (стабильность определяли хранением препаратов при и в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,7) faxitu образом, активность препарата, Об| а«5отайного Рлутаров1ам альЖегидом, палАвт до 76% в течение 180 Мин в то время как акт оность препарата без обработки глутаровым альдегидом Снижается до 76% уже в течение 90 мин т.е/ в 2 раза быстрее. Формула изоб1)етения Способ получения и юбилизoвaнныx ферментов nyTefi ковалеитного связывания ферментов с водонерастворимыми носителями, предварительно активированньми 1,4-бензохнноном, о т личаюцийся ем, что, с целью увеличения термостабнльности целевых продуктов, и «4bбйлизoвaнныe ферменты дополнительно обрабатывсйот глутаровымальдегидом в количестве , 0,5-3 . на 1 г носителя при 4-40с в течение 1-24 ч. Источники информации, принят : во внимание при экспертизе , 1. Иммобилизбванные ферменты. Сб. под ред. Березина И.В, Антонблэа В.К Мартинека К.,т. 1. М,, изд-во МГУ, 1976. 2. Патент США О 2615349, кл. С 07 G7/OOj 1976 (прототип).