Способ получения иммобилизованных ферментов Советский патент 1979 года по МПК A61K38/43 

I

Настоящее изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, в частности к способу получения иммобилизованных ферментов углеводного обмена, которые могут найти применение при промышленном получении глюкозы из крахмала и инвертного сиропа. В литературе описано большое число способов получения иммобилизованных ферментов 1. Несмотря на это обстоятельство поиски оптимальных в промышленном отношении носителей и способов иммобилизации продолжаются. С технологической точки зрения наиболее оптимальными являются неорганические носители. Разработаны различные способы активации этих носителей для последующей иммобилизации на них белков-ферментов 1. Однако эти способы обычно трудоемки и часто активность иммобилизованных ферментов невысока.

Известен, например, способ получения иммобилизованных ферментов 2 путем ковалентного связывания ферментов с. неорганическим носителем, активированным кремнийорганическими соединениями обшей формулы:

yrtSiR4-n,

где У - радикал, содержаший амино-, карбонильную, карбоксильную, оксифенильную

или сульфгидрильную группы; R - алкоксиили фенокси-радикал, галоген; .

В этом способе активированный носитель не имеет функциональных групп, способных непосредственно взаимодействовать с функциональными группами белка с образованием устойчивой ковалентной связи. Для образования такой связи требуется или дополнительная активация функциональных групп носителя перед иммобилизацией, или иммобилизацию проводят в присутствии сшивающих агентов.

Целью описываемого способа является устранение недостатков известного способа, т. е. упрощение процесса иммобилизации и повышение активности иммобилизованных ферментов. Указанная цель достигается за счет того, что иммобилизацию ферментов проводят на неорганическом носителе, активированном у-глицедоксипропилтриэтоксиСиланом

(С2Н50)&1Сснр-Осн,гн-сн, оо

Силанизированный носитель содержит активные эпоксидные группы, -способные непосредственно взаимодействовать с функциональными группами белка. Иммобилизацию белка обычно осуществляют при знэчениях рН, близких к рН-оптимуму действия ферментов; это способствует сохранению активности ферментов и при температуре 20-40°С, что значительно сокращает время иммобилизации.

Согласно изобретению, описывается упрощенный способ получения иммобилизованных ферментов, обладающих высокой активностью. Способ заключается в том, что ферменты иммобилизуют на «еорганических носителях, активированных предварительно у-глицедоксипропилтриэтоксисиланом.

Предпочтительно процесс проводят следующим образом.

I стадия - актив ация носителя. Неорганический носитель обрабатывают 2,5- 10%-«ым. раствором -у лицедоксипропилтриэтоксисилана в апротонном растворителе. Активированный носитель промывают апротонным растворителем и сушат. Активированный носитель суспендируют в растворе фермента при значениях рН, близких к рН-оптимуму действия иммобилизуемого фермента, и проводят иммобилизацию при 20-40°С. После промывки буфером и водой определяют активность иммобилизованного фермента. За единицу активности глюкоамилазы принято количество фермента, производящего 1 мкмоль глюкозы за 1 мин при гидролизе 1%-ного раствора крахмала (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,7, 30°С). За единицу активности глюкозооксидазы принято количество фермента, производяи1,его 1 мкмоль Н202 за 1 мин при инкубации в 3%-ном растворе глюкозы (0,1 М ацетатный буфер, рН 5,6, 30°С). Активность определяли титрометрическим методом или по убыли глюкозы. За единицу активности инвертазы принимают количество фермента, которое превращает 1 мкмоль сахарозы в глюкозу и фруктозу за 1 мин при инкубации в 7%-яом растворе сахарозы (01 М ацетатный буфер, рН 4,7, 30°С).

Пример l.KlOr силохрома С-80 прибавляли 30 мл 2,5% (об.) раствора у-глицедоксипропилтриэтоксисилана в ацетоне и оставляли в контакте на 15 мин ; затем избыток жидкости сливали, а силохром высущивали при 100°С в течние 5 ч. К 0,5 г модифицированного силохрома прибавляли раствор глюкозооксидазы с активностью 25 ед. в 5 мл ацетатного буфера (рН 5,6) и перемещивали на качалке нри в течение 2 ч. Активность иммобилизованной глюкозооксидазы составляла 30 ед./г носителя, т. е. 60% от исходной активности.

Пример 2. В качестве известного способа для сравнения активности иммобилизованных ферментов был взят способ иммобилизации, описанный в прототипе 2.

Смесь 2 г силохрома и 10 мл 10%-ного (об.) раствора 7 минопропилтриэтоксисилана в толуоле кипятили 10 ч, затем силохром отфильтровывали, промывали ацетоном и высущивали на воздухе. К 2 г полученного силохрома прибавляли 1 г п-нитробензойной кислотьГи 10 мл 10%-ного дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофу5 ране и перемещивали в течение 2 суток при комнатной температуре. Силохром отфильтровывали, примывалн горячим метанолом (200 мл) и водой, а затем нрибавляли 5 г дитнопита натрия в 500 мл воды. Смесь

10 кипятили 0,5 ч, затем силохром промывали водой, ацетоном и высущивали.

К 1 г полученного силохрома прибавляли 10 мл 0,1 н. раствора ПС1 и после охлаждения до 6°С порциями прибавляли 50 мг

15 нитритацатрия. Затем силохром промывали холодной дистиллированной водой, прибавляли 10 мл охлажденного раствора глюкозооксидазы (50 ед.) и перемещивали при 6°С в течение ночн. Активность иммобилизованной глюкозооксидазы 24,6 ед., что составляет 50% от исходной активности. Таким образом, применение способа, согласно изобретению, позволяет получить иммобилизованную глюкозооксидазу с активностью

5 па 10% больше, чем по способу, описанному в прототипе.

Пример 3. К 0,5 г силохрома, активированного у-глицедоксипропилтриэтоксисиланом, согласно прнмеру 1, прибавляли

0 5 мл раствора инвертазы с активностью 400 ед. в ацетатном буфере с рН 4,5 и перемещивали 2,5 ч при 30°С. Активность иммобилизованной инвертазы 656 ед/г носителя, что составляет 82% от исходной ак5 тивности.Для сравнения проводили иммобилизацию инвертазы по методике, описанной в прототипе. Активность полученного иммобилизованного препарата инвертазы 496 ед/г

0 носителя, что .составляет 62% от исходной активности. Таким образом, способ, согласно изобретению, позволяет получать препарат иммобилизованной инвертазы с активностью на 20% больше, чем по известному

5 снособу.

Пример 4. К 10 г силохрома, активированного у-глпцедоксипропилтриэтиоксисиланом, согласно примеру 1, прибавляли

0 10 мл раствора глюкоамилазы с активностью 200 ед. в ацетатном буфере с рН 4,7 и перемешивали 2 ч при 40°С. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 280 ед/г носителя, что составляет 70% от исходной

5 активности.

Для сравнения нроводнли иммобилизацию глюкоамилазы по методике, описанной в прототипе. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 60 ед/г носителя (активность нативного фермента 100 ед.), что составляет 60% от исходной активности. Таким образом, способ согласно изобретению позволяет получить иммобилизованную глюкоамилазу с активностью на 10% выше,

чем по известному методу.

Формула изобретения

1.Способ получения иммобилизованных ферментов путем ковалентного связывания ферментов с неорганическим носителем, активированным органосиланом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации и повышения активности иммобилизованных ферментов, в качестве органосилана используют глицедоксипропилтриэтоксисилан.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что для активации носителя используют 2,5-10%-ный раствор -глицедоксипропилтриэтоксисила на.

3.Способ по п. I, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят при значениях рН, близких к рН-оптимуму действия ферментов.

4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят при 20- 40°С.

5.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют глюкоамилазу.

6.Способ по п. 1, otличaющийcя тем, что в качестве фермента используют

инвертазу.

7.Способ по п. 1, отличающийся тем, что Б качестве фермента используют глюкозооксидазу.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют силохром.

9. Способ по п. I, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют силикагель.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Иммобилизованные ферменты. Т. 1, 2. Ред. И. В. Березин, В, К- Антонов и

К. Мартинек. МГУ, 1976.

2.Патент США № 3519538, кл. 195-63, опубл. 1970 (прототип).