Способ получения иммобилизованной микробной инвертазы для гидролиза сахарозы Советский патент 1990 года по МПК C12N11/00 C12N11/14 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммобилизованных ферментов для гидролиза сахарных сиропов, и может быть ис- , пользовано в пищевой промышленности.

Целью изобретения является увеличение выхода иммобилизованной инвер- тазы и повышение ее термостабильности.

Способ заключается в следующем.

Иммобилизацию инвертазы проводят на кремнеземе, модифицированном у- аминопропилтриэ токсисиланом, активированном глутаровым альдегидом и по- мещенном в термостатированный реактор колонного типа в водном растворе саха- розы с концентрацией 50-70% при 4060°С. Затем реактор промывают водой и обрабатывают водным раствором глу- тарового альдегида при температуре 15-25°С для активации и стабилизации поверхности иммобилизованного фермента. Полученный препарят промывают водой и на него наносят следующий слой инвертазы в высококонцентрированном водном растворе сахарозы в тех же условиях, что и первый. Потом препарат снова активируют и стабилизируют глутаровым альдегидом в тех же условиях, что и предыдущий. Таким образом, получают многослойный препарат иммобилизованной инвертазы с требуемой активностью Затем в том же реакторе, где проводилась иммоби Сп

Ј

00 О

лизацня инвертазы, проводится непрерывный гидролиз сахарных сиропов с Той же концентрацией (50-70%) при той же температуре (40-60°С), причем сахарные сиропы подаются в реактор с противоположным направлением движения жидкости по сравнению с проведением процесса иммобилизации. После снижения скорости гидролиза опять проводится процесс активации иммоби- лизованной инвертазы глутаровым альдегидом в тех же условиях с последующей иммобилизацией нового слоя инвертазы и ее стабилизацией глутаровым альдегидом, аналогично описанному выше. Этот процесс повторяют до тех пор, пока активность иммобилизованной инвертазы не достигнет требуемого уровня. Процесс иммобилизации и активации иммобилизованного фермента проводят с противоположным направлением движения жидкости по сравнению с процессом гидролиза. После этого для проведения процесса гид ролиза сахарозы опять меняют направление потока жидкости и т.д.

Проведение процесса иммобилизации инвертазы в выаококонцентрирован ном растворе сахарозы при повышенной температуре (условия процесса гидролиза сахарозы ) позволяет химически зафиксировать фермент в акти- , вированном состоянии, что существенно повышает его активность и термостабильность.

Применение предложенного способа позволяет увеличить выход иммобилизованной инвертазы от 38-39 до 47- 72%, а также повысить термостабильность иммобилизованного фермента на 20-39%.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. К 10 г силохрома С-80 добавляют 25 мл 5%-ного водного раствора у-аминопропилтриэтоксисила на, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, затем избыток жидкости сливают, а сило- хром прогревают при 120&С в течение 8ч, Полученный модифицированный силохром промывают водой до исчезновения остатков силана и высушивают при 60°С. Содержание аминогрупп - 0,37 мг«экв/г носителя. 1 г сухого модифицированного силохрома помещаю в стеклянную термостатированную ког лонку, соединенную с перистальтиче

0

5

0

5

0

5

0

5

ким насосом. Через колонку в течение

1ч прокачивают 10 мл 2,5%-ного (0,25 мл/г носителя) водного раствора глутарового альдегида при 20°С.

В течение всего процесса иммобилизации подача жидкости в колонку осуществляется сверху вниз со скоростью 5 мл/мин. Избыток глутарового альдегида отмывают водой. В качестве фермента используют грибную инвертаэу инвертаваморин ПЮх с активностью 4000 ед./г. Через колонку в течение

2ч пропускают раствор, состоящий

из 1 мл водного раствора грибной инвертазы с активностью 450 ед./мл и 10 мл 67%-ного раствора сахарозы в воде, при 60 °С. Полученный препарат промывают водой. Активность иммобилизованной грибной инвертазы составляет 302 ед./г носителя (67% от исходной активности фермента, взятого для иммобилизации). С целью активации поверхности иммобилизованного фермента и повышения его стабильности через колонку пропускают в течение 30 мин при 20°С 10 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида (0,25 г/г носителя) , На этой стадии заканчивается получение однослойной иммобилизованной инвертазы. После промывки водой активность однослойного активированного и стабилизированного фермента составляет 324 ед./г носителя (72% от активности исходного фермента).

Для нанесения второго слоя инвертазы через колонку с препаратом снова пропускают раствор, состоящий из } мл грибной инвертазы с активностью 450 ед./мл и О мл 67%-ного раствора сахарозы в воде, в течение 2 ч при 60°Со Полученный препарат промывают водой, активируют и стабилизируют его поверхность пропусканием через колонку 10 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида (0,25 г/г носителя) в течение 30 мин при 20°С. Активность двухслойной иммобилизованной инвертазы составляет 584 ед,/г носителя (58% от активности фермента, взятого для получения второго слоя иммобилизованного фермента).

В тех же условиях проводят иммобилизацию третьего и четвертого слоев инвертазы. Активность трехслойного фермента 813, четырехслойного - 1025 ед./ г, что составляет соответственно 51 и 47% от активности фермента, взятого для получения каждого из слоев, или 57% от общей активности инвертазы, пошедшей на все четыре слоя иммобилизованного фермента, После тщательной промывки водой колонка с многослойной иммобилизованной инвертазой готова для про ведения процесса гидролиза сахарозы. П р и м е р 2. Используют иммобилизованный фермент, полученный в примере 1. Процесс гидролиза сахарозы проводится в той же колонке, что и процесс иммобилизации, однако сахарный скроп подается в колонку не сверху вниз, а снизу вверх. Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации: при 60 С и концентрации сахарозы 67%. Скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза сахарозы,3 мл/ч. После того, как скорость подачи сиропа, необходимая для достижения 100%-ного гидролиза, снижается до 2,1 мл/ч, проводится процесс восстановления активности колонки. Для этого колонка с иммобилизованным ферментом опять промывается водой, причем направление потока жидкости меняется на подачу растворов сверху вниз. Активность иммобилизованного фермента составляет 724 ед./г. В условиях примера 1 проводят повторную активацию четырехслойной иммобилизованной инвертазы водным раствором глутарово- го альдегида и иммобилизацию пятого и шестого слоев фермента. Ак- .

5

0

5

0

5

равно 5, Активность фчгмента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы ,450 ед. Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 3 мл/ ин, поток жидкости направлен г-- ,;зу чверх. Время процесса иммобилизации на каждой стадии 3 ч, температура 40°С, концентрация сахарного сиропа 50%. Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стации 1 ч, темпера-тура 5°С, концентрация 1,5 г/г носи- тег.я (15%-ный водный раствор). Активность однослойной грибной инвертазы 308, двухслойной - 556, трехслойной - 747, четырехслсйной - 972 и пятислойной - носителя, что составляет 53% от эбщей активности фермента, прошедшего на все пять слоев иммобилизованной грибной инвертазы.

Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации - при 40 С и концентрации сахарозы 50% Подачэ жид- KOv-тч в колонку осуществляется сверху вниз, скорость подачи сиропа, необходимая для I00%-ного гидролиза сахарозы, 3,2 мл/Чо После того, как скорость подачи сиропа, необходимая для достижения 100%-ного гидролиза снижается до 2,5 мл/ч, проводится процесс восстановления активность иммобилизованного фермента в тех же условиях, что и процесс иммобилиза-- ции (аналогично примеру 2). В результате число слоев иммобилизованной

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов для гидролиза сахарозных сиропов, и может быть использовано в пищевой промышленности. Цель изобретения - увеличение выхода иммобилизованной инвертазы и повышение ее термостабильности. Способ заключается в ступенчатом связывании инвертазы на кремнеземных сорбентах, модифицированных органосиланом и активированных глутаровым альдегидом, в присутствии 50-70%-ного раствора сахарозы при 40-60°С, а также в проведении дополнительной обработки глутаровым альдегидом после связывания последней порции инвертазы. Способ позволяет увеличить выход иммобилизованной инвертазы от 38-39 до 47-72%, а также повысить термостабильность иммобилизованного фермента на 20-39%. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

тивность пятислойной иммобилизованной 40 инвеРтазы увеличивается с 5 до 6, а

инвертазы 950, шестислойной - 1097 ед./г. После достижения требуемого уровня активности направление потока жидкости опять меняется на противоположное, а на колонке в тех же условиях проводится гидролиз сахарозы.

П р и м е р 3. Для иммобилизации используют модифицированный силохром полученный по примеру 1. Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицирование- го силохрома, соединенной с перистальтическим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы

45

активность с 938 до 1140 ед,/г носи теля. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях.

Пример4. Для иммобилизации используют модифицированный силохром полученный по примеру 1. Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабили 50 зацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированно . го силохрома, соединенной с перистал тическим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 4о Активность фермента, добавл емого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед.

55

инвеРтазы увеличивается с 5 до 6, а

активность с 938 до 1140 ед,/г носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях.

Пример4. Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный по примеру 1. Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабили- зацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированно- го силохрома, соединенной с перистальтическим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 4о Активность фермента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед.

Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 4 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз Время процесса иммобилизации на каждой стадии 0,5 ч, температура 60°С, концентрация сахарного сиропа 70% Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 0,5 чэ тем- пература 25°С, концентрация 0,05 г/г носителя (0,5%-ный водный раствор), Активность однослойной грибной ин- вертазы 318, двухслойной - 562, трехслойной - 752 и четырехелойной - 954 ед./г носителя, что составляет 53% от общей активности фермента, пошедшего на все четыре слоя иммобилизованной грибной инвертазы.

Процесс гидролиза сахарозы про- водится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации: при 60 С и концентрации сахарозы 70%. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая до 100%-ного гидролиза сахарозы, 2,8 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 1,9 мл/ч проводите..: процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях 5 что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2), В результате число слоев иммобилизованной инвертазы увеличивается с 4 до 6, а активность - с 647 до 921 едо/г носителя,Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях.

Пример 5. Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный в примере 1в Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стаби- . лизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2 Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силохрома, соединенной с перистдль

тическим насосом. Количество слоев

иммобилизованной грибной инвертазы равно 3. Активность фермента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы,, 450 ед« Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 2 мл/мин, поток кости направлен сверху вниз Время процесса иммобилизации на каждой стадии 5 и, температура 70°С, кон

0 5 о

Q 45

5

50

g

центрация сахарного сиропа 80%, Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 2 ч, температура 25°С, концентрация 2 г/г носителя (20%-ный водный раствор), Активность однослойной грибной инвертазы 144, двухслойной - 272, трехслойной - 356 ед,/г носителя, что составляет 26% от общей активности фермента, пошедшего на все три слоя иммобилизованной грибной инвертазы„

Низкая активность иммобилизованного фермента объясняется термоинактивацией грибной инвертазы в ходе процесса иммобилизации, которую не предотвращает даже высокая концепт- рация субстрата, а также инактивиру- ющим действием высокой концентрации бифункционального реагента - глутаро- вого альдегида

Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации: при 70°С и концентрации сахарозы 70%, Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх,скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза сахарозы, 1,1 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 0,7 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2)о В результате число слоев иммобилизованной инвертазы увеличивается с 3 до 4, а активность - с 227, до 332 ед„/г но си тетя. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях

П р и м е р 6, Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный по примеру 1. Активацию силохрома, иммобилизаций слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 20 Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силохрома, соединенной с перистальтическим насосом Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 3. Активность фермента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед. Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 5 мл/мин поток жидкости направлен сверху вниз Время процесса иммобилизации на каждой стадии 45 мин, температура 30°С, концентрация сахарного сиропа 40%, Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 45 мин, температура 25°С, концентрация 0,025 г/г носителя (0,25%-ный водный раствор). Активность однослойной грибной инвертазы 165, двухслойной - 282, трехслойной - 392 ец./г носителя, что составляет 19% от обще активности фермента, пошедшего на все три слоя иммобилизованной грибной инвертазы.

Низкая активность иммобилизованного фермента объясняется низкой концентрацией глутарового альдегида и высокой вязкостью сахарозы при 30°С. Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации: при 30°С и концентрации сахарозы 40%. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза сахарозы, 0,7 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 0,5 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2) о В результате число слоев иммобилизованной инвертазы увеличивается с 3 до 4, а активность с 280 до 365 ед./г носителя. Затем на колону ке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях.

Пример, Для иммобилизации используют модифицированный сили- кагель МСА-750, полученный по методике примера 1. Количество аминогрупп 0,32 мг-экв/г носителя. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силикагеля, соединенной с перистальтическим насосом. В качестве фермен- та использовали дрожжевую инвертазу марки А /Олайне/ с активностью 100000 ед./г. Активацию силикагеля, иммобилизацию слоев дрожжевой инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят- аналогично примерам 1 и 2. Число слоев иммобилизованной дрожжевой инвертазы равно 1. Активность фермента,

15

н, . й

- 5641861°

добавляемого для получения ванного фермента, 3780 ц. Сгорогтп подачи растворов в процессе иммобилизации 5 мл/мин, поток жидкости направлен снизу вверх. Время процесса иммобилизации 2 ч, температура 45 С, концентрация сахарного сиропа 55%, Время обработки глутаровым альдеги- дом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 30 мин, температура , концентрация 0,30 мг/г носителя (3%-нь-н водный раствор). Активность однослойной дрожжевой инвертазы 2020 носителя, что составляет 53% от активности фермента,, пошедшего на иммобилизацию.

Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и про10

15

20

25

30

35

40

45

50

S5

условиях, что цесс иммобилизации: при 45 С и концентрации сахарозы 55%. Подача жидкости в колонну осуществляется сверху вниз, скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза сахарозы, 6 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 4 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2)., В результате число слоев иммобнлизо-г- вакной инвертазы увеличивается с 1 по 2, а активность - с 1350 до 3260 ед./г носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях со скоростью 9,5 мл/ч. После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 7 мл/ч опять проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, в ре-. зультате чего число слоев увеличивается до 3, а активность меняется с ,2400 до 4360 ед./г носителя, после чего на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы.

ПримерЗ. Для иммобилизации используют модифицированный силика- гель, полученный по примеру 7. Активацию силикагеля, иммобилизацию слоев инвертазы, их активацию и стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированного силикагеля, соединенной с перис- тальтическим насосом. Препарат состоит из 4 слоев иммобилизованных инI

вертаз. В первом и третьем слоях находится дрожже зая инвертаза, во втором и четвертом - инвертеза. Активность фермента, добавляемого для получения слоя дрожжевой инверта- зыэ 3780 ед дня получения слоя грибной инвертазы 450 ед. Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 3 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз„ Время процесса иммобилизации на каждой стадии 2 ч9 температура 50°С9 концентрация сахарного сиропа 67% Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 30 мин, температура 20°С концентрация 0,2 г/г носителя (2%-ный водный раствор). Активность однослойной иммобилизованной инвертазы 21805 двухслойной 2460 „ трехслойной - 4380, четырех- слойной - 4630 еДо/г носителя, что составляет 55% от общгй активности фермента, пошедшего на все четыре слоя иммобилизованного фермента.

Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс иммобилизацк : при 50 С и концентрации сахарозы 67%. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза саха розыг 13,5 мл/ч, После снижения скорости 100%-ного гидролиза до мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2) причем вначале проводится иммобилизация дрожжевой инвертазы,а сверху- иммобилизация слоя грибной инвертазы В результате число слоев иммобилизованной инвертазы увел чиваетсяс 4 до 6,а активность- с 2740до 4910 ед./г носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях,

Ниже приведены данные по термостабильности препаратов иммобилизованных инвертаз, Стабильность определяли по сохранению активности (в процентах) при хранении препаратов в 0Э05 М ацетатном буфере с рН 4,7 при 60 °С в течение 3 ч„ Препараты с индексами возле номеров получены восстановлением активности препаратов после процесса гидролиза сахарозы,,

Ю

15

20

25

30

35

8612

Таким образом, использование предложенного изобретения позволяет значительно увеличить выход иммобилизованной инвертазы (с 38-39% до 47- 72%), а также повысить термостабильность иммобилизованного фермента на 20-39%. Формула изобретен ч я

и многократное повторение активации глутаровым альдегидом и связывания следующих порций инвертазы, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода иммобилизованной инвертазы и повышения ее термостабильности, связывание инвертазы проводят при 40-60°С в присутствии 50- 70%-ного раствора сахарозы, а после связывания последней порции инвертазы проводят дополнительную обработку глутаровым альдегидом.

2,Способ по п.1, отличающийся тем, что связывание инвертазы сорбентом проводят в том же реакторе, в котором осуществляют гидролиз сахарозы, причем оба процесса проводят в противотоке..