Способ получения иммобилизованных ферментных препаратов Советский патент 1978 года по МПК C07G7/02 

1

Изобретение касается технологии ферментных препаратов и может быть использовано в пищевой, фармацевтической и химической промышленности.

Известны многочисленные способы иммобилизации ферментов 1.

Все известные способы иммобилизации можно разделить на четыре основных метода: адсорбции, ковалентного связывания с носителем, заключения ферментов в гель и микроинкапсулирование.

Кроме того, для иммобилизации могут также успешно использоваться и комбинации перечисленных методов.

Прототипом изобретения является способ получения иммобилизованных ферментов, представляющий собой комбинацию ковалентной иммобилизации и иммобилизации путем изоляции фермента с помощью полупроницаемой мембраны (микроинкапсулирование) 2.

Этот способ включает ковалентное связывание фермента в присутствии субстрата с гидрофильным носителем, содержащим реакционноспособные группы и последующее покрытие частиц носителя с иммобилизованным ферментом полупроницаемой оболочкой, причем носитель получают при взаимодействии гексаметилендиамина и бисульфитиого производного карбоксилсодержащего полимера, например полиакролеина. В состав полупроницаемой

оболочки, которой покрывают частицы, входят различные производные целлюлозы, например карбоксиметилцеллюлоза, ацетилцеллюлоза и др.

Однако такой способ длителен и трудоемок, поскольку процесс получения носителя длится от 18-20 ч до 4 дней и ведется в атмосфере азота при повышенных температурах (65- 75°С). Процесс собственно иммобилизации длится 18 ч. В способе используются высокоочищенные ферменты и дорогостоящие реактивы, что увеличивает себестоимость получаемых иммобилизованных препаратов.

Кроме того, мелкие размеры частиц носителя с ферментом создают большое сопротивление при работе в непрерывно действующих колонках, что ограничивает их применение в технологических процессах.

С целью упрощения процесса получения иммобилизованных ферментных препаратов при одновременном снижении себестоимости получаемых препаратов предлагается способ, состоящий из механического связывания фермента в присутствии субстрата с гидрофильным носителем - силикагелем, путем обкатки частиц силикагеля в растворе фермента и последующего покрытия частиц полупроницаемой оболочкой на основе ацетилцеллюлозы.

В настоящее время силикагель широко применяется в практике иммобилизации ферменTUB и др. биологически активных соединений как нейтральней носитель, обладающий высокой- )бцион.ной способностью, химической инертностью, | хорошими физическими свойствами-.у Отечественная промышленность выпускает несколько видов силикагелей не только с хорошо развитой поверхностью, но и со строго определенным размером пор, что обеспечивает известную изоирательность :В отношении молекул иммобилизуемого веш,ества.

Технология способа состоит в следуюш,ем.

Силикагель в виде сферических частиц с диаметром 2-3 мм обкатывают в дражировочном аппарате в водной смеси следующего состава, %:

lipenapaT фермента1,0

Субстрат фермента1,0

Крахмал1,0

Аэросил0 5

Карбоксиметилделлюлоза 0,5

Субстрат, вводимый в смесь для обкатки, служит -ДЛЯ стабилизации фермента, остальные компоненты служат для более прочного связывания фермента с носителем. При этом аэросил может быть заменен акриламидом, а карбоксиметилделлюлоза может быть исключена из состава смеси.

Нанесение на носитель смеси указанного состава производится путем распыления при вращении дражировочного аппарата со скоростью 50-6U об./мин. Распыление смеси производится порциями, затем частицы носителя с нанесенной смесью подсушиваются в течение нескольких минут теплым воздухом (30- 35С). После нанесения всего количества смеси частицы подсушиваются и погружаются в охлажденный () раствор пленкообразователя - 1 % ацетилцеллюлозы в смеси ацетона и этанола, и высушиваются теплым воздухом. Операцию покрытия пленкой повторяют дважды и окончательно подсушивают частицы током теплого воздуха.

Пример 1. В качестве препарата фермента использован препрат р-галактозидазы, в качестве субстрата - лактоза. Активность препарата по лактозе составляет 150- 200 ед./г.

За единицу активности принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля субстрата за 1 мин при рН 4,2 и 30°С.

Для обкатки частиц носителя используют 50 мл водной смеси следующего состава, %: р-Галактозидаза1,0

Лактоза1,0

Крахмал1,0

Аэросил0,5

Карбоксиметилцеллюлоза 0,5

Нанесение смеси на частицы силикагеля (10 г) производится в дражировочном аппарате при постоянном его вращении методом распыления. Распыление производится порциями по 3-5 мл, после нанесения каждой порции частицы подсушиваются в течение 2-3 мин током теплого воздуха (30-35°С). Затем частицы с нанесенной на их поверхность CMecbid и окончательно подсушенные погружаются на 5 мин в охлажденный (О-2°С) раствор пленкообразователя, содержащий 1 % ацетилцеллюлозы в смеси ацетона и этанола (60:40) и подсушиваются теплым воздухом. Операции пленкообразования и подсушивания повторяют два раза. Высушенные частицы промывают дистиллированной водой до исчезновения белка в промывных водах и снова высушивают теплым воздухом. Выход активности полученного препарата р-галактозидазы 64,8%.

Пример 2. Аналогично примеру 1 получают иммобилизованный ферментный препарат на основе р-фруктофуранозидазы (инвертазы) Asp. awamori 16. В качестве субстрата используют сахарозу. Активность инвертазы по сахарозе 5000 ед./г. За единицу активности инвертазы принимают количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкмоля сахарозы за 1 мин при 30°С. Выход активности полученного препарата инвертазы 68%.

Предлагаемый способ получения иммобилизованных ферментных препаратов обладает следующими технологическими преимуществами:

возможность использования для иммобилизации неочищенных ферментных препаратов, выпускаемых промыщленностью; максимальное сохранение нативных свойств ферментов;

возможность применения для иммобилизации любых ферментов, катализирующих превращение низкомолекулярных субстратов; осуществление процесса с помощью технологических приемов, широко применяемых в промышленности;

возможность широко варьировать размеры носителя;

низкая себестоимость получаемых препаратов иммобилизованных ферментов.

Предварительный технико-экономический расчет для строительства цеха по реализадии предлагаемого способа производительностью 20 кг препарата в сутки с активностью 10 ед./г носителя с учетом затрат на строительство цеха, приобретение и монтаж оборудования (в том числе автоматической линии «Штайнберг 18,5 тыс. руб.), основное и вспомогательное сырье, производственных рабочих и непроизводственных расходов показал следующее: Полная себестоимость

препарата99,4руб./кг.

Прибыль на 1 кг препарата400,2руб.

Общая прибыль2,4 млн. руб./год

Окупаемость0,21 месяца

Рентабельность продукции401%

В настоящее время в нашей стране препараты иммобилизованных ферментов не выпускаются, а цены препаратов, выпускаемых зарубежными фирмами, составляют 30- 120руб./г, т. е. 30000 руб./кг.

Таким образом, полнай себестбйМОсть препаратов иммобилизованных ферментов, получаемых целевым способом, составляющая при малых масштабах производства всего 100 руб./кг, в 300 раз ниже цен на аналогичные препараты, выпускаемые зарубежными фирмами.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованных ферментных препаратов, включающий связывание фермента с гидрофильным носителем в присутствии субстрата фермента и последующее покрытие полупроницаемой оболочкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве гидрофильного носителя используют силикагель, а связывание фермента с гидрофильным носителем осуществляют механически - путем обкатки частиц носителя в растворе фермента.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют р-галактозидазу, а в качестве субстрата - лактозу.

3.Снособ по н. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют инвертазу, а в качестве субстрата - сахарозу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Кёстнер А. И. Иммобилизованные ферменты. - «Успехи химии, 1974, т. 43, вып. 8, с. 1480.

2.Патент США № 3730841, кл. С 07G 7/02, опублик. 01.05.73.