Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS.мUSсULUS L.-продуцент моноклонального антитела к глутаматным рецепторам мозга человека Советский патент 1992 года по МПК C12P21/08 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть .использовано для выявления антигена - глутаматных рецепторов мозга человека.

Цель изобретения - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело к глутаматным рецепторам мозга человека, пригодное для выявления этих рецепторов, изучения их структуры и функционирования. Штамм гибридомы A-HGR-7C5 ВСКК(П) МЗбЗД получают следующим образом,

Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинно введением 50 мкг глута- матсвязывающих мембранных белков, выделенных из посмертных препаратов коры головного мозга человека и идентифицированных в экспериментах радиолигандного связывания с Н -1 -глутаматом как рецепторы глутамата, в полном адьюванте Фрёй- нда. Параллельно антиген вводят в количестве 25 мкг в хвостовую вену. Через 7 дней иммунизацию повторяют без адъю- ванта. Через 7 дн после этого мышей, сыворотка которых имеет титр 15000 (титр Определяют методом иммуноферментного анализа), иммунизируют в течение 3 дн, вводя 25 мкг антигена в хвостовую вену ежедневно. По прошествии этого времени 12x10 клеток селезенки иммунных мышей

Х|

ю о

00

о

гибридизуют с 25x10 клеток миеломы ; мыши X63.Ag8.653 в присутствии среды RPMI1640, содержащей 45% (об./об.) поли- этиленгликоля (мол.м. 3350) и 15% диметил- сульфоксида. После гибридизации и отмывки отполиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные планшеты по 2x105 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридных клеток используют среду RPMI 1640 с добавлением 10% лоша- диной сыворотки и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, .1-0 М гипрксантина,

аминоптеринаи 1,6х 10 5Мтимидина. Гибриды-продуценты клонируют методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку планшета, содержащую 4х104 кле ток селезенки в качестве фидерного слоя. После второго клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к глутаматным рецепторам мозга человека. Продукция антител сохраняется как минимум в течение 28 пассажей в культуре.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Среда для культивирования - RPMI 1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 10 мМ пирувата Na. 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот и витаминов для базальной среды Игла, 0,05 мМ меркап- тоэтанола. Культивирование проводят при 37°С в атмосфере 5% углекислоты.

Посевная доза Ю5 клеток/мл. Через 3-4 дн концентрация антител в культуральной среде достигает 10-20 мкг/мл. Контаминация бактериями, грибками и микоплазмой не обнаружена. Для длительного хранения гибридомные клетки морозят в Эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 4°С/мин до 4°С, затем 1°/мин до-70°С, после чего клетки переносят в жидкий азот. Клетки размораживают, перенося ампулы из жидкого азота в водяную баню при 37°С.

Для выращивания гибридомнрго штам- ма в асцитной форме клетки вводят внутри- брюшинно мышам линии BALB/c. обработанных пристанем, в количестве 4x106 клеток на мышь. Асцит созревает че- рез 12-14 дн.

Гибридома условно названа A-HGR- 7С5. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом A-HGR-7C5, относится к изотипу IgG, подкласс G1 и связывает над- мембранный участок глутаматных рецепторов мозга человека.

Специфичность взаимодействия антител с нейрорецепторами L-глутамата выявляют с помощью иммуноферментного и им- муногистохимического анализов.

Для получения препарата моноклональ- ных антител в количестве, необходимом для проведения иммунохимических исследований, гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см2 по 5х105 клеток в 5 мл среды RPMI 1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ глутамина, 10 мМ пирувата Na, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ меркапто- этанола. Клетки культивируют 3-4 дн при 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислоты. Культуральную среду .собирают центрифугированиемв течение 10 мин при 800д. Полученный супернатант используют для выявления специфичности, взаимодействия антитела с глутаматными рецепторами мозга человека.

Определение специфичности взаимодействия моноклонального антитела с антигеном иммуноферментным анализом.

На полистироловый 96-ячеечный планшет сорбируют антиген - 1 мкг на ячейку в 100 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН 9,6) при 4°С в течение ночи. После насыщения планшета 0,05%-ным раствором ТвинЧ 20 в фосфатно-солевом буфере (5мМ NahtePCM. 140 мМ NaCI, рН 7,4) для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком (1 ч, 20°С), в ячейки вносят 100 мкл культуральной среды штамма А- HGR-7C5 (1 ч, 20°С). Затем планшет промывают 4 раза фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05%-ный Твин-20, и вносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксида- зой хрена (2 мкг/мл, 1 ч, 20°С). После окончания инкубации несвязавшиеся продукты реакции отмывают указанным выше способом, а связавшийся конъюгат определяют по расщеплению субстрата пероксида- зы (HaCte) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Положительная реакция характеризуется развитием коричневой окраски, интенсивность которой измеряют по поглощению при 492 нм. В качестве контрольных антигенов используют глутаматутилизи- рующие ферменты: глутаматдегидрогеназу и глутаматдекарбоксипазу.

Результаты показывают, что антитела эффективно связываются с глутаматными рецепторами мозга человека и не взаимодействуют с контрольными антигенами.

Определение специфичности моноклонального антигена иммуногистохимическим анализом.

Для этого исследования используют срезы посмертных препаратов коры головного мозга человека. Полученные при аутопсии (не позднее 1 ч после смерти) образцы коры помещают в жидкий азот и используют для приготовления срезов (5 мкм). Для фиксации срезов используют 10%-ный раствор формалина в фосфатно-солевом буфере. Фиксацию проводят в течение 10 мин при 20°С. Срезы отмывают ,в течение 1 ч фосфатно-солевым буфером и наносят моноклональные антитела (культуральную среду) с добавлением 10% человеческой сыворотки (инкубация 30 мин, 20°С). После промывки фосфатно-солевым буфером (10 мин, 20°С) наносят кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши с 10% челове- ческой сыворотки. Срезы отмывают как описано выше и инкубируют с культураль- ной средой, содержащей моноклональные антитела против пероксидазы и перокеида- зу (30 мин, 20°С), отмывают снова, реакцию проявляют с помощью субстрата -диамино- бензидина в трис-HCI буфере (50 мМ трис, 150 мМ NaCI, pH 7,5) в присутствии H2U2. Моноклональное антитело выявляет интенсивно окрашенные тела нейронов, нейро- пиль, осевые цилиндры миелинизированных и немиелинизированных волокон с помощью светового микроскопа. Для определения специфики окрашивания срезы прединкубируют с L-глутаматом (100 мкм) в трис-цитратном буфере (50 мМ трис, 10 мМ CaCfc, pH 7.2) в

течение 30 мин при 37°С. Дальнейшую обработку срезов проводят ка к описано выше. Предварительная обработка срезов L-глутаматом приводит к значительному снижению, а в некоторых случаях к исчезновению окраски.

В качестве контроля в этих экспериментах используют моноклональные антитела к эндотоксину грамотрицэтельных бактерий (Ig класса М) и антитела к коллагену II (Ig класса G). С помощью этих антител не выявляют никаких структур нервной ткани.

Эти результаты свидетельствуют о вы-, сокой специфичности моноклонального антитела -A-HGR-7C5, возможности применения этого антитела в качестве маркера для выявления глутаматных рецепторов и их распределения на срезах мозга человека в норме и при различной патологии центральной нервной системы с помощью иммуноферментного метода, а в перспективе и получения чистых препаратов глутаматных рецепторов на колонках с иммобилизованными антителами.

Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П)Ы363Д - продуцент моноклонального антитела к глутаматным рецепторам мозга человека.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для обнаружения глутаматных рецепторов мозга человека. Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (МонАт) к глутаматным рецепторам мозга человека. Штамм получен на основе клеток иммунной селезенки мыши линии BALB/C и клеток мышиной миеломной линии Х-63-Ад-653. МонАт принадлежит к субклассу 1д 61. Штамм депонирован под № ВСКК(П) 363 Д. Клетки штамма культивируют в стандартных условиях на среде с 20% сыворотки, а также в виде асцитной опухоли в сингенных мышах. Изучение взаимодействия МонАт с нейрорецепторами глутамата методом иммуноферментного анализа выявило высокую специфичность, и возможность применения данного антитела для выявления иммобилизованных глутаматных рецепторов с помощью иммуноферментного метода. Связывание МонАт, продуцируемого штаммом A-HGR-7C5, с глутаматными ре- цепторами на срезах посмертных препаратов коры головного мозга человека показало, что оно получено и пригодно для сравнительного анализа распределения нейрорецепторов глутамата в норме и при патологии центральной нервной системы. И