Применение 1-гидроксигерматрана для торможения развития атеросклероза в эксперименте Российский патент 2021 года по МПК A61K45/00 A61P9/10 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и касается нового средства, влияющего на активность фосфолипаз.

Фосфолипазы играют важную роль в обмене липидов в живых организмах. Составной частью многих тканей и секретов живых организмов являются фосфолипазы группы А. Фосфолипазы А1 в большинстве своем – внутриклеточные ферменты, часто мембраносвязанные, не нуждаются в коферменте. Их молекулярные массы варьируют в пределах 15-90 тыс; оптимальная каталитическая активность проявляется при pH 4,0 (для лизосомальных ферментов) или 8,0-9,5 (для ферментов микросом, плазматических мембран и цитозоля); широко распространены в животных тканях (печень, сердце, мозг) и в микроорганизмах (Bacillus subtilis, В. megateiium, Mycobacter phlei, Escherichia coli). Фосфолипазы А1 отщепляют ацильную цепь фосфолипида в sn-1 положении. При действии фосфолипазы А1 на фосфолипид образуется 1-лизофосфолипид и жирная кислота.

Доказано, что фосфолипазы являются биомаркерами активности атеросклеротического процесса [см. Душкин М.И. Макрофаги и атеросклероз: патофизиологические и терапевтические аспекты. // Бюлл. СО РАМН (2006); № 2 (120), с.47-55.], эффективности проводимой терапии как у больных атеросклерозом, так и у больных с осложнениями атеросклероза, в частности ишемической болезни сердца – ИБС (стенокардией напряжения II ФК) [см. Богданова С.Н. Клинико-экспериментальное изучение влияния фактора питания на активность лизосомальных гидролаз тромбоцитов и мононуклеарных лейкоцитов при атеросклерозе. Автореф. дисс. канд., Москва (1992), 28 с., Данковцев Е.Н., Затейщиков Д.А. Биомаркеры в кардиологии: липопротеинассоциированная фосфолипаза А2. // Фарматека (2007); № 15 (149). Кардиология, неврология, с.22-28].

Известно, что на раннем этапе атерогенеза происходит активация эндотелия, который экспрессирует на своей поверхности адгезионные молекулы для моноцитов, нейтрофилов и лейкоцитов крови и продуцирует хемоаттрактанты, привлекающие моноциты в интиму сосудов. Моноциты, мигрирующие в субэндотелиальное пространство, дифференцируются в макрофаги, которые выступают как катализаторы образования окисленных ЛНП, миграции и пролиферации гладкомышечных клеток из мышечной оболочки в интиму. Частицы модифицированных ЛНП предпочтительно захватываются с помощью специфических рецепторов макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки. Активированные макрофаги, продуцирующие металлопротеиназы и коллагеназу, в определенных ситуациях способствуют распаду коллагена в бляшке и возникновению такого грозного осложнения, как разрыв бляшки, образование тромба и развитие инфаркта миокарда. Липидный профиль в значительной мере определяется состоянием макрофагов, их ферментативными реакциями. В этом плане заслуживают внимания исследования и разработки средств, изменяющих активность липаз макрофагов, в частности кислой фосфолипазы А1 (кФЛА1) (КФ 3.1.1.32) с оптимумом pH 4,0, вызывающей деградацию структуры фосфолипидов, отщепляя ацильные остатки от углеродных атомов C₁  в молекуле лецитина и других фосфолипидов с образованием промежуточных продуктов гидролиза – лизолецитина и лизофосфолипидов, обладающих сильным мембранотоксическим действием [см. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. - Наука, 1976, 380 с., Брокерхоф X., Дженсен Р. Липолитические ферменты, пер. с англ., М., 1978, с.242-356].

В литературе имеются сведения о возможности снижения общей (суммарной) активности кФЛА различными химическими соединениями [см. Губергриц Н.Б. «Эссенциале форте Н», «Эссенциале Н» в гепатологии и гастроэнтерологии. Сучасна гастроентерологiя, № 5 (43), 2008, с.79-89].

Известно также, что при введении некоторых препаратов, например, липостабила, который оказывает гиполипидемическое действие, происходит активация кислых и щелочных фосфолипаз [см. Самсонов М.А., Васильев А.В., Погожева А.В., Бобкова С.Н. Сравнительная оценка гиполипидемического действия ПНЖК w-3 и липостабила. //Вопр. питания, 1996, № 4, с.12-16].

Однако существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих активностью в отношении фосфолипаз.

В качестве ближайшего аналога может быть указан источник: Расулов М.М., Стороженко П.А. и др. Трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (цитримина или цинкатрана) для снижения общей активности кислой фосфолипазы А1// Патент на изобретение RU №2545888 С1, 10.04.2015.

Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (цитримин) обладает широким спектром терапевтического действия и отвечает формуле:

(НОСН₂СН₂)₃N - Zn(ООССН₂OС₆Н₄СН₃-2)₂

цитримин имеет следующий вид:

К недостатку прототипа можно отнести меньший эффект угнетения активности фосфолипазы.

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового средства, которое возможно применить для снижения общей активности кислой фосфолипазы А1.

Технический результат – расширение арсенала средств, обладающих свойством снижать общую активность кислой фосфолипазы А1 за счет выявленной новой биологической активности 1-гидроксигерматрана.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства, понижающего общую активность кислой фосфолипазы А1, предлагается использовать синтезированное ранее (см. Воронков М.Г., Адамович С.Н. и др. Синтез новых биологически активных O-гидрометаллоатранов //ЖОХ, 2009, т.79, №1, С.162-163), биологически активное соединение – 1-гидроксигерматран, или герматранол-гидрат, который имеет формулу:

1-гидроксигерматран, имеет следующий вид:

Известно свойство герматранол-гидрата стимулировать экспрессию матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы [см. Расулов М.М., Стороженко П.А. и др. Герматранол-гидрат, стимулирующий экспрессию матричной РНК триптофанил-тРНК-синтетазы. Патент РФ № 2553986 С1, 20.06.2015].

1-гидроксигерматран может быть применён в клинической медицине для создания препаратов, обладающих антигиперлипидемическим действием и не имеющих побочных эффектов.

Заявляемая биологическая активность 1-гидроксигерматрана в качестве средства, обладающего свойством снижать активность кислой фосфолипазы А1, не была известна и в литературе не описана.

Впервые показано, что введение 1-гидроксигерматрана влияет на активность лизосомального липолитического фермента из класса гидролаз (КФ 3.1.1): кФЛА1 (КФ 3.1.1.32).

Предлагается применение 1-гидроксигерматрана в качестве средства, угнетающего общую (суммарную) активность лизосомального липолитического фермента кислой фосфолипазы А1.

При этом 1-гидроксигерматран может применяться в виде раствора в официальном растворе 0,9% натрия хлорида или в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде.

При этом раствор может содержать 5-20 мас.% 1-гидроксигерматрана.

Активное вещество может применяться в дозе 5,0 мг/кг массы животного.

При разработке изобретения авторы использовали различные растворители для получения средства для воздействия на активность кислой ФЛА1. Были испытаны различные растворы на водной основе, в частности раствор вышеуказанного активного вещества в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде и в официальном 0,9% растворе натрия хлорида. При этом во всех случаях были получены аналогичные результаты. Следует отметить, что нами исследовались полученные таким образом растворы с различной концентрацией активного вещества – 1-гидроксигерматрана (5%, 10%, 20%, 50%, 70%). При этом положительные эффекты от их использования, отмеченные ниже, значимо не различались. В исследованиях использовали различные дозы активного вещества: от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг массы животного. Эффект угнетения активности фермента кФЛА1 присутствовал во всех случаях и был прямо пропорционален дозе используемого активного вещества. Соответственно, для достижения указанного нами технического результата важным является как таковое новое свойство данного соединения, а не его доза или конкретный водный растворитель. Поэтому ниже, в примере, приведен для демонстрации только опыт с использованием активного вещества в дозе 5,0 мг/кг ежедневно. В данном случае применяли раствор активного вещества, который приготовляли ex tempore, используя официальную дистиллированную воду, смешивая с ней активное вещество.

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована представленным ниже примером.

Пример

Эксперименты проводили на кроликах Шиншилла с исходной массой тела 1,8-2,0 кг в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации». Правила утверждены приказом Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 г №267 (Правила лабораторной практики в Российской Федерации Министерства здравоохранения РФ Приказ от 19 июня 2003 года № 267 http:// www.kodeks.ru (24 апреля 2010г)). Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемыми для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животным проводили эвтаназию цервикальной дислокацией 5-го позвонка, соблюдая правила «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).

1-гидроксигерматран смешивали «ex tempore» до полного растворения в официальной дистиллированной воде.

Комплекс трис-(2-гидроксиэтил)амина с бис-(2-метилфеноксиацетатом) цинка (аналог, цитримин) так же смешивали «ex tempore» до полного растворения в официальной дистиллированной воде.

Гиперлипидемию вызывали методом Н.Н. Аничкова (известная модель развития атеросклероза).

Животных группировали по 10 голов следующим образом:

1) группа опыта, которым вводили внутримышечно свежеприготовленный водный раствор 1-гидроксигерматрана в дозе активного вещества 5,0 мг/кг массы животного ежедневно в течение 2 месяцев.

2) группа плацебо-контроля, которым вводили внутримышечно эквиобъёмное количество официального 0,9% раствора натрия хлорида ежедневно в течение 2 месяцев.

3) группа животных, получавших внутримышечно свежеприготовленный раствор аналога – цитримина в дозе активного вещества 5,0 мг/кг массы животного ежедневно в течение 2 месяцев.

Эталоном служили данные, полученные у интактных кроликов.

В конце экспериментов у животных в грудном отделе аорты стандартными методами определяли содержание липидов, триацилглицеринов, β-липопротеинов и холестерина. Для определения активности кислой фосфолипазы из кусочков грудной аорты диспергированием выделяли клетки интимы методом, описанным в: Нагорнев В.А. Методология в изучении проблемы атеросклероза. // Мед. акад. ж. 2005, т.5, в.3, с.121-133. Для этого использовали раствор (0,5 мл), содержащий коллагеназу – тип 4 и эластазу – тип 3 («sigma», США). Время диспергирования – 75 мин при 37°С (1 мл/50 мг ткани). Полученную суспензию клеток промывали холодным раствором Хенкса. Осадок при последней промывке гомогенизировали в 2 мл 0,25М раствора сахарозы pH 7,4 с 0,001 м ЭДТА. Конечное разведение гомогенатов аорты соответствовало 1:20 (вес:объем). Супернатант использовали для исследования активности кислой фосфолипазы (кФЛА1). Активность кФЛА1 определяли спектрофотометрически по известному методу [см. Булычев А.Г., Семенова Е.Г., Ассиновская О.А. Влияние агрегации нейтрального красного, акридинового оранжевого и хлористого аммония клетками (сублинии) на активность лизосомальных гидролаз. // Цитология. - (1986). Т.28, № 7. С.703-711], используя в качестве субстрата ß-нафтилкаприлат («sigma», США). К 0,2 мл исследуемого материала добавляли 0,5 мл субстратного раствора в 0,2 М ацетатного буфера, pH 5,2, с 0,2% тритоном Х-100, инкубировали на водяной бане в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл «fast blue В» («serva», ФРГ) (1 мг/мл в 0,05 М фосфатного буфера, pH 7,2), через 5 мин добавляли 1 мл 10% охлажденного раствора трихлоруксусной кислоты, еще через 3 мин – 1,5 мл этилового эфира уксусной кислоты, затем образцы встряхивали, центрифугировали на центрифуге WKH-1 при 150 g 15 мин. Отбирали 0,5 мл верхней фазы в микрокювету и проводили спектрометрию при 525 нм. Суммарную активность кФЛА1 выражали в микромолях β-нафтола, образовавшегося за 1 мин на 1 г белка.

Статистическую обработку данных проводили методом Стьюдента. Данные представляли в виде средних и стандартных значений ошибки – М и m, соответственно. Достоверными считали различия при р ≤ 0,05 (см. Петри А., Сэбин К., 2009).

Результаты ферментативного анализа представлены в таблице 1 и демонстрируют улучшение липолитических показателей и уровня кФЛА1 при заявленном применении как по сравнению с контролем, так и по сравнению с аналогом.

Корреляционный анализ выявил связь средней силы между уровнем активности кФЛА1 и показателями липидного обмена после введения 1-гидроксигерматрана (таблица 2).

Активацию системы лизосомального липолиза можно рассматривать как компенсаторную реакцию ферментных систем на фоне преобладания неспецифического, нерегулируемого эндоцитоза модифицированных липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) или надмолекулярных ЛПНП-содержащих комплексов. При этом в условиях субстратного насыщения может возникнуть относительная недостаточность отдельных лизосомальных ферментов (в частности, кФЛА1), расщепляющих этерифицированный холестерин (ЭХС), что приводит к аккумуляции ЭХС и триглицеридов в клетках крови и повышению риска развития атеросклероза [см. Нагорнев В.А. Методология в изучении проблемы атеросклероза. // Мед. акад. ж. 2005, т.5, в.3, с.121-133]. Наряду с этим изменения в состоянии лизосомального аппарата интимы можно расценивать и как адаптационные перестройки на стадии липоидоза, и как результат функциональной недостаточности на стадии образования фиброзной бляшки.

Таким образом, реакции кислой фосфолипазы 1 указывают на структурно-функциональные нарушения в деятельности субклеточных структур при развитии атеросклероза и, соответственно, полезными могут быть средства – модуляторы таких реакций.

Установление новых свойств 1-гидроксигерматрана позволит использовать его, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину при развитии атеросклеротического процесса. Также он может быть использован для образования вторичных посредников или предшественников в синтезе биологически активных веществ – эйкозаноидов. Ввиду важности выявленного механизма корреляции активности ферментной системы в зависимости от состояния организма 1-гидроксигерматран можно будет использовать не только для профилактики и/или лечения состояний, связанных с нарушением нормальной функции фосфолипаз А1 макрофагов, но и при скрининге, например, соединений, обладающих аналогичной активностью.

Таблица 1.

Показатели липидного обмена при применении водного раствора 1-гидроксигерматрана

Показатели Ткань аорты Эталон - интактные Липиды общие (мМ/л) 0,2±0,014 Холестерол (мМ/л) 0,11±0,02 Триацилглицерины (мМ/л) 0,13±0,01 β-липопротеины (мМ/л) 0,09±0,002 Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) 0,9±0,03 Плацебо - контроль Липиды общие (мМ/л) 5,1±0,09** Холестерол (мМ/л) 4,2±0,9** Триацилглицерины (мМ/л) 4,16±0,1** β-липопротеины (мМ/л) 4,1±0,1** Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) 5,3±0,2** Аналог – цитримин в дозе 5,0 мг/кг Липиды общие (ммоль/л) 1,52±0,07* Холестерол (ммоль/л) 2,15±0,05* Триацилглицерины (ммоль/л) 2,8±0,08* β-липопротеины (ммоль/л) 1,61±0,04* Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) 2,15±0,1* Опыт – 1-гидроксигерматран в дозе 5,0 мг/кг Липиды общие (мМ/л) 0,61±0,02* Холестерол (мМ/л) 0,24±0,03* Триацилглицерины (мМ/л) 0,2±0,01* β-липопротеины (мМ/л) 0,21±0,02* Кислая фосфолипаза А1 (мкМ/мин/ на 1г белка) 0,99±0,04*

Примечание : * - p<0.05 по отношению к плацебо - контролю;

** - p<0.05 по отношению к эталону.

Таблица 2.

Коэффициенты корреляции (r) активности кислой ФЛА1 в ткани аорты с показателями липидного обмена при применении водного раствора 1-гидроксигерматрана

Энзим Липиды общие Холестерол Триацил -
глицерины ß-липо-протеины кФЛА1 r=0,35 r=0,34 r=0,44 r=0,43

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и касается применения водного раствора 1-гидроксигерматрана формулы: в качестве средства, понижающего общую активность кислой фосфолипазы A1. Изобретение понижает общую (суммарную) активность лизосомального липолитического фермента – кислой фосфолипазы А1. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 пр.

1. Применение 1-гидроксигерматрана формулы:

в качестве средства, угнетающего суммарную активность лизосомального липолитического фермента – кислой фосфолипазы А1.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что 1-гидроксигерматран используют в виде водного раствора в официальном растворе 0,9% натрия хлорида или в воде для инъекций, официальной дистиллированной воде.

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что 1-гидроксигерматран используют в виде раствора, содержащего 5-20 мас.% активного вещества.

4. Применение по п. 3, отличающееся тем, что применяют раствор, содержащий активное вещество 1-гидроксигерматран в дозе 5,0 мг/кг массы животного.