Способ количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах, например в кормовых дрожжах.

Цель изобретения - экспрессное определение азота и сырого протеина.

Способ количественного фотометрического определения азота и сырого протеина в биологических материалах осуществляется следующим образом.

В колбу Кьельдапя вместимостью 250 см вносят 0,4-0,5 г (точная навеска) измельченного биологического материала с содержанием азота 10- 60 мг, добавляют 8-10 см 30%-ного раствора перекиси водорода, перемешивают, добавляют 13-14 см концентрированной серной кислоты, содержащей селен, и вйовь хорошо перемешивают. Колбу помещают на электроплитку и проводят озоление до полного обесцвечивания раствора. Время озоления составляет 1,5-2 ч. После осветления раствор охла:(дают и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 Раствор доводят до 200 см дистиллированной водой и перемешивают-.

Для определения азота предлагаемым фотометрическим способом в мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см минерализата с содержанием концентрированной серной кислоты 0,25- 0,35 см и добавляют 18-22 см 10%- ного раствора трехзамещенного фосфор- но-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра.. Пробы хорошо перемешивают Q верный и хорошо воспройзводимьм

и добавляют 15 см гипобромита, приготовленного при смешивании двух частей 0,07 М раствора гипохлорита и одной части 2%-ного раствора бромистого калия в 10%-ном, растворе двузамещен- ного фосфорно-кислого калия. Содержимое колбы вновь хорошо перемешивают и оставляют стоять 3 мин, затем объем доводят до 100 см дистиллированной водой и вновь перемешивают.

Точно так же подготавливают холостую пробу на реактивы, где вместо 5 см минерализата биологического материала вносят 5 см раствора, содержащего, как и в испытуемой пробе, 0,25-0,35 см концентрированной серной кислоты. Измерение оптической плотности проводят на спектрофотометре при 330 нм в кюветах с толщиной

45

50

55

В качестве биологического ма риала взяты дрожжи, содержащие сырого протеина (определяют титр метрическим способом),

Пример 1, В мерную колб вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют бюретки 16 см 10%-ного раствор трехзамещенного фосфорно-кислог лия в 0,45 М раствора едкого на перемешивают и добавляют 15 см бромита. Пробу вновь хорошо пере

затем

дистилл ванной водой, вновь хорошо перем вают и измеряют оптическую плот раствора на фотоэлектроколориме типа КФК-2 в кюветах с толщиной 30 мм при долине волны 365 нм. В

шивают и отстаивают J мин, объем доводят до 100 см

слоя 10 мм 1ти на фотоэлектроколори- метре типа КФК-2 при 365 нм в кюветах с толщиной слоя 30 мм,

О содержании азота судят косвенно по избытку гипобромита, не вступившего в реакцию окисления аммиака до азота. При измерении оптической плотности растворов из-за меньшей окраски, которую имеет испытуемая проба.

ее используют в качестве контроля, измеряя относительно нее оптическую плотность холостой пробы.

Содержание азота находят по калибровочной кривой, которую строят в пределах от 250 до 1500 мкг, используя в качестве стандартного раствора аммоний хлористый в концентрации 1,91 г/дм

Пересчет на сырой протеин проводят путем умножения количества определенного азота на коэффициет 6,25,

С целью уточнения концентрации раствора трехзамещенного фосфорнокислого кал11Я в смеси с едким натром, обеспечиваюБ ;им рН, оптимальный для проведения реакции с гипобромитом, проведен ряд экспериментов,

Б качестве биологического материапа используют товарные кормовые дрожжи рода Candida, выпускаемые гидролизными заводами микробиологической промьшшенности, и низший плесневой гриб Paecilomyces carneus, выращенный fta гидролизате древесины. Определение сырого протеина проводят фотометрическим и титриметрическим способом Титриметрический способ взят для сравнения, как наиболее досто

В качестве биологического материала взяты дрожжи, содержащие 50,5% сырого протеина (определяют титриметрическим способом),

Пример 1, В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют из бюретки 16 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра, перемешивают и добавляют 15 см гипобромита. Пробу вновь хорошо перемезатем

дистиллированной водой, вновь хорошо перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектроколориметре типа КФК-2 в кюветах с толщиной слоя 30 мм при долине волны 365 нм. Время

шивают и отстаивают J мин, объем доводят до 100 см

анализа 10 мнн. Во всех последующих примерах время анализа остается практически постоянным. Определено сырого протеина 48,1%, Результат определения занижен по сравнению с титримет- рическим способом, принятым за эталон на 4,8 отн.%. Такая точность определения азота неприемлема и получена из-за недостаточного количества буферного раствора, взятого меньше минимального количества.

Пример 2, В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см

кислого минерализата, добавляют из бюретки при помешивании 8 см 0%- ного раствора трехзамещенного фосфор- но-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1,

Определено сырого протеина 50,3%.

Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом сос- тав-ляет 0,4%, что является вполне приемлемым и соответствует минимальному использованию буферного раствора.

Пример 3, В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата, добавляют из бюретки 20 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1,

Определено сырого протеина 50,7%.

Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом сос- тавляетО,4%, Данное количество буферного раствора является оптимальным.

Пример 4, В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 См кислого минерализата, добавляют из бюретки 22 см 10%-ного раствора трех замещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1,

Определено сырого протеина 51,1%.

Относительное отклонение по сравнению с титриметрическим способом составляет 1,2%. Точность определения вполне приемлема и соответствует максимальному количеству расходования буферного раствора.

Пример 5. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата и добавляют 24 см 10%- ного раствора трехзамещейного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра и далее по примеру 1.

Определено сырого протеина 51,8%,

кис- см0

5

0

g

Относительное отклонение составляет 2,5%, Дальнейшее увеличение количества добавляемого буферного раствора снижает точность измерения и выходит за рамки выбранного диапазона,

Примере. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см лого минерализата и добавляют 20 10%-ного раствора тр хзамеп(еиного фосфорно-кислого калия в 0,35 М раст-, воре едкого натра и далее, по примеру 1.

Определено сырого протеина 48,9%.

Относительное отклонение от титри- метрйческого способа определения составляет 3,2%, Изменение молярности за рамки диапазона снижает точность измерения.

Пример. В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см кислого минерализата и добавляют 20 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40 М раст- 5 воре едкого натра и далее по -примеру 1 .

Определено сырого протеина 50,9%.

Относительное отклонение от титри- метрического определения составляет Q 0,8%. Точность приемлема и соответствует минимуму необходимой молярности.

Пример 8.В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 5 см минерализата и добавляют 20 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорнокислого калия в 0,48 М растворе едкого натра и далее по примеру 1.

Определено сьфого протеина 50,2%,

Относительное отклонение от титри- 0 метрического определения составляет 0,6%. Точность приемлема и соответствует максимуму необходимоймолярности.

Пример 9, В мерную колбу

5

0

вместимостью 100 см вносят-5 см 5 минерализата и добавляют 10 см 10%- ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,50 М растворе едкого натра и далее до примеру .1 ..

Определено сырого протеина 49,9%.

Относительное отклонение от титри- метрического определения составляет 1,2%. Точность определения значительно снижается, так как молярность выше максимума.

В табл. 1 представлено определение сырого протеина в кормовых дрожжах рода Candida и в биомассе гриба Paecilorayces ca rneus в зависимости

от количества и концентрации предлагаемого буферного раствора.

Из данных табл. 1 следует, что результаты определения азота и сырого протеина, полученные при добавле- НИИ 10%-ного раствора трехзамещенног фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра в количестве 18- 22 см, хорошо сопоставимы с титри- метрическим способом. В этих случаях относительное отклонение от титримет рического способа не превьпиает 2,5%„ Оптимадьной добавкой является 20 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра. Добавление такой концентрации при всех определениях имеют, наименьшее относительно отклонение от титриметрического способа, которое не првышает 0,8%, .

Добавка свыше 22 см буферного раствора приводит к небольшому, но систематическому завьппению результатов определения количества сырого протеина, а при добавлении буферного раствора меньше 18 см получают данные, отличающиеся от данных, полученных титриметрическим способом, ;почти на 6%,

Добавление к минерализату 20 см 10%-ного раствора трекзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М раствора едкого натра обеспечивает достаточно высокую эффективность использования предлагаемого способа, Введение в пробы для анализа 20 см 10%-ного трехзамещенного фосфорнокислого калия в 0,40 М и 0,48 М растворах едкого натра также дает результаты практически одинаковые с резуль татами титриметрического анализа. При использовании буферного раствора на 0,50 М едком иатре в случае определения сырого .протеина в низшем грибе получен результат вьппе титримет- рического на 4,6 отн„%, что неприемлемо,

В табл. 2 приведены сравн}1тельнь:е результаты по определению сырого протеина в дрожжах пробы 1 ,, полученные известным и предлагаемым способами.

Для анализа один и тот же образец дрожжей подвергают минерализации в пяти повторностях. Затем в каждом полученном минерализате проводят три параллельных определения содержания сырого протеина различными способами: титриметрическим, ютометрическим по ГОСТу, косвенным фотометрическим по реакции с гипобромитом после предварительной нейтрализации минерализа- та 1 М растворам едкого натра и предлагаемым косвенным фотометрическим методом по реакции с гипобромитом после добавления 20 см буферного раствора 10%-ного трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,45 М растворе едкого натра.

Проведенная статистическая обработка этих данных показьшает, что наименьшее отклонение результата при доверительном уровне 0,95 имеет титри- метрический способ определения сырого протеина. При использовании извест- ног о фотометрического способа определения (согласно ГОСТу) находят сырого протеина меньше, в среднем на 1 ,5 отн, и при большем отклонении результата, чем при,определении сырого протеина титриметрическим способом.

Формула изобретения

Способ количественного определения азота и сырого протеина в биологических материалах, включающий минерализацию образца койцентрированной серной кислотой, окисление аммиака до азота гипобромитом и фотометрическое определение азота, отличающийся тем, что, с целью экспресс ности анализа, после минерализации в пробу добавляют буферный раствор, состоящий из 18-22 см 10%-ного раствора трехзамещ€ нного фосфорно-кислого калия в 0,40-0,48 М растворе едкого натрия.

n

u-1

CS

«

о

cc

01

40

A

о

11

Й&

Заказ 3101/39Тираж 776ГГодписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб,, д, 4/5

„Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблиц а 2

Изобретение относится к аналитической химии, а более конкретно к способам количественного определения азота (А) и сырого протеина (СП) в биологических материалах, например в кормовых дрожжах. Целью из,обрете- ния является экспрессное определение азота и сьфого протеина. Способ включает следующие операции: минерализацию образца концентрированной серной кислотой, окисление аммиака до А ги- побромитом и фотометрическое определение концентрации А, Добавление в пробу биологического материала буферного раствора в виде 18-22 см 10%-ного раствора трехзамещенного фосфорно-кислого калия в 0,40-0,48 М растворе едкого натра обеспечивает экспрессное определение А и СП. 2 табл. с W QO к ел со О5 tc