Способ количественного определения иммунных комплексов в крови Советский патент 1987 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к иммунологии, точнее к методам определения количества циркулирующих в крови иммунных комплексов (ЦНК),

Цель изобретения - повышение точности путем одновременного определения фиксирующих и не фиксирующих ком- апемент иммунных комплексов (ИК) в крови.

Способ осутцествляется следующим образом.

Количественно определяют иммунные комплексы в сыворотке крови, включаю- fllpe инкубацию исследуемой пробы с ре- агентом, содержащим субкомпонент комплемента Cjrt, отделяют связавшиеся комплемент фиксирующие иммунные ком- гшексы и определяют их количества, Причем исследуемую пробу инкубируют С эритроцитами, обработанными глута- ровым альдегидом и связанными с субкомплементом Cj , в сыворотке, полученной после отделения комплементфик- ёирующих иммунных комплексов, и в ис- Ходной сыворотке с помощью лазерной нефелометрии определяют соответственно уровень содержания не фиксирующих комплемент иммунных комплексов и oбпJ уровень содержания иммунных комплек- Сов, по разности которых делают заключение о содержании иммунных комплексов, фиксирующих комплемент.

Пример. Эритроциты человека 0(1) группы, Rh+, после тщательного отмывания (до 10 раз) в изотоническом растворе (0,9%) хлорида натрия суспензируют в 0,25%-ном растворе глютаральдегида на том же изотоническом растворе хлорида натрия. Суспен- зию инкубируют в течение 3 ч при 37°С и затем вновь отмывают в изотоническом растворе. К одному объему эритроцитов добавляют семь объемов 0,25%-ного глютаральдегида и 0,01%- ного азида натрия в изотоническом растворе. Эритроциты в таком растворе хранятся в течение года при 4 С.

Вьщеление Cjn проводили с помощью Эффинной хроматографии на иммуйосор- банте из CNBr-активированной сефа- розы 4В, к которой ковалентно присоединяли InG человека из расчета 30 мг на 1 мл сефарозы (2). На колонку с 5 мл сорбента, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером на 0,15 М хлорида натрия с 0,01 М ЭДТА, наносят 25 мл человеческой плазмы (порциями по 5 мл) и элюнруют тем же буфером со скоростью 80 мл/ч. Колонку с сорбентом промывают до полного исчезновения белка, после чего проводят злюцию 0,2 М гексаметилендиамином. Элюаты диали- зуют против 0,3 М хлорида натрия в течение 24 ч при 4°С. В реакции двойной диффузии в агарозе с анти-Сг сывороткой фракции исследуют на наличие Cj . Используемые условия позволяют получить 1,2 мг белка Cjn с концентрацией 200-300 мкг/мл. Полученный Cfq, хранили при -45 С.

Перед исследованием сывороток на наличие иммунных комплексов ех tempore проводят конъюгирование С с тест- эритроцитами (эритроциты, обрабо тан- ные глютаральдегидом). Для этого эритроциты тщательно отмывают в изотоническом растворе и к одному объему осадка эритроцитов добавляют двадцать объемов раствора Cj (к 50 мкл осадка добавляют 1 мл раствора Cj. - 0,2 мг/мл). Суспензию тщательно встряхивают и инкубируют 2 ч при 37°С.После инкубации эритроциты отмывают от избытка С j и к осадку эритроцитов, нагруженных добавляю пять объемов исследуемой сыворотки пациента (50 мкм н- 250 мкл с-ыворотки) . Сыворотку с конъюгатом С,- эритроцит инкубируют 30 мин при 37°С с периодическим потряхиванием каждые 5- 7 мин. После инкубации эритроциты осаждают центрифугированием (2500 об./мин) в течение 10 мин, надосадочную сыворотку отбирают, для определения уровня ЦИК, не связавшихся с С, , В сыворотке, не инкубированной с конъюгатом Сjg-эритроцит, определяют уровень всех ЦИК, а в сыворотке, проинкубированной с конъюгатом, определяют уровень не фиксирующих комплемент ЦИК.

Определение проводят следующим образом. К 25 мкл сыворотки добавляют 1 мл 3,5%-ного раствора полиэтилен- гликоля (мм 6000) на изотоническом растворе NaCl, смесь инкубируют при встряхивании в течение часа при комнатной температуре. В образцах измеряют степень светорассеяния на лазерном нефелометре Behring Institute (кюветы объемом 1 мл, Д 638 нм). Концентрацию ИК высчитывают по калибровочной кривой, полученной при измерении степени светорассеяния агрегированного Y -глобулина - искусственного аналога ИК.

Применение нового реагента позволяет вьщелить ИК, фиксирующие комплемент, и обеспечить определение действительного уровня ЦИК (как фиксирующих, так и не фиксирующих комплемент) .

Формула изобретения ю

Способ количественнбго определения иммунных комплексов в крови, включающий инкубацию исследуемой пробы с субкомпонентом комплемента CJQ, фиксированного на эритроцитах, и осаждение комплементфиксирующих иммунных комплексов, отличающийся

5

тем, что, с целью повьппения точности путем одновременного определения фиксирующих и не фиксирующих комплемент иммунных комплексов, дополнительно определяют содержание иммунных комплексов в сыворотке до инкубации с субкомпонентом комплемента С, и после осаждения комплементфиксирующих иммунных комплексов, по разнице содержания между ними определяют количество комплементфиксирующих иммунных комплексов, величине содержания иммунных комплексов после осаждения комплементфиксирукзщих иммунных комплексов определяют количество не фиксирующих комплемент иммунных комплексов.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - повьппение точности. Определяют содержание иммунных комплексов в сьшоротке крови. Инкубируют исследуемую пробу с реагентом, содержащим субкомпонент комплемента Cj-. Отделяют связавшиеся ком- штемент и фиксирующие иммунные комплексы и определяют их количества. В исходной сьшоротке определяют уровень не фиксирующих комплемент иммунных комплексов и общий уровень иммунных комплексов. По их разнице делают вывод о содержании иммунных комплексов, фиксирующих комплемент. Способ позволяет определить действительный уровень циркулирующих иммунных комплексов в крови. . (