Способ получения коллагеновых пептидов,содержащих участок связывания с фибронектином Советский патент 1988 года по МПК C07K14/78 

11

Изобретение относится к усовергаен ствованному способу получения колла- геновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, биологически активных соединений, которые находят применение в биохимии.

Цель изобретения - упрощение процесса коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронекти- ном, повьшени е выхода целевого продукта.

Пример I. Получениеd -СВ 7 бромдианового пептида коллагена.

А. Бромциан - фрагментация целой молекулы коллагена. Раствор 180 мг коллагена из кожи крыс в 8 мл 70%-ной муравьиной кислоты насыщают N., добавляют 200 мг бромистого циана и полученную смесь инкубируют 5 ч при . Реакционную сМес% обессоливают iicL колонке с биогелем Р-2 (V 100 мл), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой. Скорость тока 45 МП/ч. Фракцию, выходящую с исключающим объемом колонки,.лиофили- зуют и получают 165 мг смеси бром- циановых пептидов коллагена,

Б. Выделение о 1-СВ7 пептида из смеси бромциановых пептидов коллагена. Полученную смесь бромциановых пептидов коллагена (165 мг) растворяют в 20 мл 0,05 М трис-НС рН 7,4, с 0,15 М хлористым натрием при нагревании до и раствор перемешивают при 20°С в течение 1 ч с 15 мл сефарозы 4В, содержащей иммобилизованный желатинсвязывающйй домен фиб- ронектина (мол.в. 45000) (содержание домена в адсорбенте 1-2 мг/мл упакованного объема геля). Затем адсорбен упаковыв.ают в колонку, промывают . уравновещивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, со- держапщм 1 М мочевину (50 мл). Скорость тока 200 мл /ч. d 1-СВ7 пептид элюируют уравновешивающим буферным раствором, содержащим 4 М мочевину Фракцию, содержащую о 1-СБ7 пептид, обессоливают на колонке с биогелем Р-2, уравновещенным 0,1 М уксусной кислотой, и лиофилизуют. ВЫХОДО/1-СВ пептида 7,5 мг-.(25%). Продукт бып электрофоретически гомогенным при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата нат рия (мол. в. около 25000).

При скорости потока 150 ьш/ч, температуре 37°С получают o I-GB7 пептид с выходом 27%.

5

5

5 0 5

0

II , 2

П р И М е р 2. Получение насцент- Hbix коллагеновых пептидов, содержапшх участок связывания с фибропектинон.

Раствор смеси насцентных Р|„-пепти- дов, полученных в бесклеточной системе биосинтеза белка и меченных Н- пролином (суммарная радиоактивность 1,5-10 распадов/мин), в 3 мл 0,05 М трис-НСI, рН 7,6, с 0,15 М хлористым натрием инкубируют в течение 1 ч при с 3 мл иммобилизованного на се- фароэе 4В желатинсвязывающего домена фибронектина. Адсорбент упаковывают в колонку, промывают 40 мл уравновешивающего буферного раствора до отсутствия радиоактивности в элюатах. Скорость тока 200 мл/ч. Затем колонку, промывают 1 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе (15 мл) и насцентные пептиды, коллагена, содержащие участок связывания с фибронектином, элюируют В И мочевиной в уравновешивающем буферном растворе. Суммарная радиоактивность полученной фракции (6 мл) - 5-10 распадов/мин. После диализа этой фракции против 0,05 М трис- НС1 буферного раствора, рН 7,6, содержащего 1 М хлористый натрий, проводят анализ целевых насцентных пептидов коллагеназной реакцией.

Аналогичные результаты получены При проведении хроматографии смеси насцентных пептидов при и скорости тока 250 мл/Ч .

К О,I мл исходных и полученных после хроматографии насцентных пептидов, меченных Н-пролином ( МО распадов/мин), добавляют 10 мкл раство.ра коллагеназы (1-5 мкг белка), свободной от примеси других проте- иназ. Контрольные пробы не содержат коллагеназу. Пробы инкубируют в течение 90 мин при 37°С, после чего пептиды осаждают равным объемом ,10%-ной трихлоруксусной кислоты с 0,5% таннина. Осадки собирают на фильтры (Millipor), высушивают и определяют радиоактивность в сцинтил- ляционном счетчике. Расщепление Р„- пептидов рассчитьюают по формуле

.р i-i

r,/.-iuu - ,

где 0„ - радиоактивность опытных

проб;

К - радиоактивность контрольных проб.

Согласно полученным данным исходная смесь насцентных Р„-пептидов расщеплялась коллагеназой на 15%, в то время как насцеитные пептиды, элюиро ванные с а()финного адсорбента 8 М. мочевиной в уравновешивающем буферном растворе, расцеплялись на 90%, Таким образом элюированный с колонки препарат на 90% состоит из нас- центных коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронек- тином.

П р и м е р 3. А. Получение жела- тинсвязывающего домена фибронектина.

300 мг лиофилизованного фибронектина из пЛазмы крови человека суспендируют в 60 мл 0,025 М трис-НС буфеного раствора, содержащего 0,5 ммоль ЭДТА и 50 ммоль NaCl (рН 7,0), добавляют I мг о(-химОтрипсина и смесь инкубируют при перемешивании 1 ч при 37°С. Затем к смеси добавляют 3 мг ингибитора трипсина из соевых бобов и 1 ммоль фенилметилсульфонилфторида через 10 мин центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин, супер натант наносят на колонку (V 60 мл) с желатин (сефарозой) уравновешенную 0,025 М трис-НС1 буферным раствором с 0,5 ммоль ЭДТА и 50 ммоль NaCl (рН 7,0), колонку промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 -ИМ в элюатах и жела тинсвязывающий домен фибронектина элюировали, добавляя в буферный раст вор А М мочевину. Соответствующие фракции (л- 60 мл) диализуют против 2л О, М уксусной кислоты. Выход желатинсвязывающего домена после лиофилизации - 25 мг, мол. масса около 45000. При электрофорезе в I2,5%-полиакриламидном гепе е присутствии додрцилсульфоната натрия продукт был гомогенен.

Б. Получение адсорбента домен фибронектина (мол. масса 43000) - сефароза 4В.

Лиофилизованный желатинсвязываю- щий домен фибронектина, полученный в п. А (25 мг),растворяют в 15 мл 0,1 М бикарбонатного буферного раствора, рН 8,4, содержащего 0,15 М NaCl и перемешивают с 15 мл BrCN - активированной сефарозы 4В (активи- рована по стандартной методике с ис- пользованием 2 г BrCN на 10 мл упакованного объема сефарозы) в течение 16 ч при 4 с. Сорбент пррмывают 50 мл того же буферного раствора.

5

5

0

5

75

S 0

5

0 5

0

1.1 .

50 мл во№1 и перемешивают 2 ч при 20 С с 15 мл 1 М раствора этанолами- на (рН 9 с помощью 6 н. НС1). СЬрбент отделяют и трижд1 1 промывает по 50 мл О,1 М натрийацетатного буферного раствора с 1 М NaCl, рН 4,5 и.0,1 М иатрийборатного буферного раствора с 1 М NaCl, рН 9. После промывания водой сорбент хранят в виде суспензии в воде в присутствии 0,02% азида натрия. Количество присоединенного домена определяют дифференциальным методом по разности поглощения при . 280 им исходного раствора лиганда и промывных вод после присоедщиения. Сорбент содержал 1,5 мг домена на I мл упакованного объема геля.

Такие параметры хроматографичес- ког о процесса, как геометрия колонки или условия последующего обессоли- вания соответствующих фракций не сказываются на конечных результатах. Обессоливание фракций проводят на колонках с биогелем Р-2, уравновешенных 0,1 М уксусной кислотой, при скорости тока 30-50 мл/ч и объемном соотношении вводимого образца к общему объему колонки 1:5. Те же результаты получены и при использовании для обессоливапия сефадекса С-25. Что касается скорости тока при афинной .хроматографии, то хроматографию денатурированного коллагена и коллагеновых пептидов обычно проводят при. темпера - туре до 40°С и при большой скорости тока из-за склонности этих биополимеров к ренатурации и гелеобразованию. Поэтому скорость тока в описываемом процессе целесообразно поддерживать в интервале 150-250 мл/ч. Выбор уравновешивающего буферного раствора (.0,05 М трис-НС j рН 7,4-7,6 с 0,1- 0,15 NaCl) обусловлен необходимостью создания на колонке оптимальных условий для взаимодействия иммобилизованного домена с пептидами, содержащими участок связывания с фибронектином. При использовании 0,04-0,06 М буферов результаты выделения оказываются практически идентичньми, как и в случае , использования 0,i-0,15 М концентраций NaCl. Применение концентраций NaCl менее 0,1 М приводит к менее чистым пептидам, содержащим участок связывания с фибронектином, а более 0,15 М - к элюированию части этих пептидов при промывании колонки урав новешивающим буферным раствором и

513

1 Н мочевиной в том же буфере, что уменьшает выход целевого продукта.

Стадия промывания колонки 1 М мочевиной предназначена для удаления с колонки неспицифически адсорбирр- ванных пептидов, не содержащий участка связывания с фибронектином. Для цели использованы растворы мочевины в концентраций.}-1,5 М. При концентрации мочевины меньше 1 М не- специфические пептидь удаляются не полностью загрязняя целевбй продукт при концентрации большей, чем 1,5 М происходит частичное элюироваИие коллагеновых пептидоЬ, содержащих участок связывания с фибронектином, что снижает выход целевых продуктов. То же относится и к условиям элюции, поскольку согласно биохимическим данным -В М мочевина эффективно разобщает биоспёцифическое взаимодействие фибронектина и коллагена (желатина) При использовании концентрации мочевины меньшей, чем в описываемом про- цессе возможно вымывание пептидов неспецифически связанных с сорбентом за счет электростатических или гидрофобных взаимодействий.

П р и М е р 4. Раствор бромциано- вых пептидов о 1-цепи коЛлагена (100мг в 12 мл 0,06 М трис-HCl, рН 7,5 с 0,1 М хлористым натрием перемешивают при в течеш е 1ч с 10 мл сефа- розы CL-4B, содержащей иммобилизован- .Ный желатин-связывающий домен фибро- нектийа (1 мг/мл упакованного объема), сорбент упаковывают в колонку, промывают уравновешивающим буферным раствором (50 мл), затем тем же раствором, содержащим 1,5 М мочевину (30 мл). Скорость тока 150 мл/ч.Целе- вой о( 1- СВ7 пептид элюируют уравнове

Составитель В.Волкова Редактор Т.Герасимова Техред И.Верес

Заказ 3392

Тираж 348Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, PayllIc aя наб., д. 4/5

Производственно-полиг рафическое предприятие, г. Ужгород;, ул. 11р1Н ктпяя,

s

о

75

Q s

0

35

0

116

шивающим буферным раствором, содержа- ЩУ1М 6М мочевину. Соответствующую фракцию обессоливают на колонке с биогелем Р-2 уравновешенным О, М уксусной кислотой, лиофилизируют. Выход о(1-СВ7 пептида 4,4 мг (24,5%) i Продукт идентичен с 1-СВ7 пептиду, полученному в примере 1 .

Описываемый способ получения нас- . центных пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, позволяет сократить число стадий с 5 до 2 время проведения процесса сокращается в три раза, выход увеличивй- ется в пять раз (с 5% до 25%).

Формула изобретения

Способ получения коллагеновых пептидов, содержащих участок связыва- ,ния с фибронектином, включающий бром- анфрагментирование коллагенна, и последующую хроматографию смеси бром- циановЫх пептидов с использованием в качествеэлюента буферных растворов, отличающийся тем, что, с целью упрощ1вния процесса и повьше- ния выхода, хроматографию проводят на сефарозе с иммобилизованным жела- тинсвязывающим доменом фибронектина, ypaв oвeщeннoм 0,04-0,06 М трис-НС1 буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,10-0,15 М хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч, температуре 37-40°С с последующим промыванием колонки 1-1,5 М мочевиной в уравновешивающем буферном растворе, элюирование коллагеиовых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, проводят 4-8 М растворами мочевины в том же буферном растворе.

Корректор А.Тяско

Изобрет ние касается пептидов, в частности пс лучения коллагеновых пептидов, со;;ер ая1их участок связывания с фиб1кпи кти 1ом, которые используют в биохимии. Цель - упрощение процесса и повьпиение выхода- целевых продуктов. ПолучеЙие ведут бромциан- фрагментированием коллагена с последующим хроматографированием в определенных условиях, Хроматографирова- ние ведут на сефарозе с иммоболизиро- ванным желатин-связывающим доменом фибронектином, уравновешенном 0,04- 0,06 М трис-НС1-буферным раствором с рН 7,4-7,6, содержащим 0,1-0,15 М. хлористого натрия при скорости тока 150-250 мл/ч и 37-40 С. Затем полон- ку промывают 1-1,5 М мочевиной в урапновешивафщем буферном раст норе, а элюирование коллагеновых пептидов, содержащих участок связывания с фибронектином, проводят 4-8 М растворами мочевины в указанном выше буферном растворе. Способ позволяет сократить число стадий с 5 до 2, время процесса в три раза и повысить выход с 5 до 25%. СО ts9 СП