Способ получения сорбента для выделения фибронектина Советский патент 1992 года по МПК B01J20/30 C07K3/20 

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу получения биоспецифического сорбента для выделения и очистки биологически-активного белка - фибронек- тина.

Фибронектин - высокомолекулярный полифункциональный гликопротеин, который принимает участие в различных функциях клеток, включая адгезию клеток, формирование экстрацеллюлярного мат- рикса и изменения цитоскелета, клеточную подвижность, фагоцитоз, дифференцировку и онкологическую трансформацию.

Известен способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на СефарозеСЫВ, активированной бромцианом. Полученный таким способом сорбент содержит желатина 3-5. мг на 1 мл геля и имеет емкость по фибронектину - 1 мг на 1 мл геля. Элюция буфером, содержащим ЗМ мочевину, приводит к десорбции высокоочищенного фибронектина с 65% выходом.

Однако недостаточно высокий выход белка, низкие механические и гидродинамические характеристики сорбента не позволяют использовать его в крупномасштабной хроматографии фибронектина.

Известен способ получения сорбента для выделения фибронектинэ, основанный на иммобилизации желатина на карбокси- метилцеллюлозе, активированной тионилх- лоридом. Элюция белка с сорбента осуществляется 4-4,5 М раствором мочевины при рН 7,4-7,5. Использование данного сорбента позволило повысить выход фибронектина в 1,5 раза по сравнению с желатин- Сефарозой и достигнуть 90% чистоты белка. Однако желатин-КМ целлюлоза, представ- . ляющая собой набухающий в воде пористый мягкий органический гель не может быть использована для препаративной наработки фибронектина.

сл С

XI xj х| О СЛ

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к настоящему изобретению является способ получения сорбента для выделения фибро- нектина путем иммобилизации желатина на силикагеле, активированном глутаровым диальдегидом и нитритом натрия. Иммобилизацию желатина проводят одновременно с активацией силикагеля и последующей сшивкой желатина бисакриламидом. Ука- занный способ позволяет получить сорбент с повышенной емкостью (1,3-2,2 мг фибро- нектина на 1 мл носителя). Полученный сорбент обладает высокой стабильностью и не теряет своих свойств при 50-кратном ис- пользовании в течение 3-х месящев работы. Основным недостатком вышеуказанного способа является его двухстадийность и использование целого ряда органических реагентов, в том числе высокотоксичного бисакриламида.

К недостаткам указанного способа также можно отнести то, что полученный согласно ему сорбент не предназначен для препаративного выделения фибронектина, а служит лишь для аналитического определения фибронектина в плазме крови. Использование сорбента для препаративной очистки фибронектина из плазмы ограничено малой производительностью сорбента при хроматографии (допустимая скорость потока плазм.ы через колонку объемом 2,5 мл составляет 0,25-0,5 мл/мин). В связи с этим сорбент по способу-прототипу позволяет получить биоспецифически сорбиро- ванныйфибронектинс

производительностью 0,043-0,067 мг/мл хмин.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение производитель- ности Сорбента в процессе выделения фибронектина.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения сорбента для выделения фибронектина, заключающимся втом, что в качестве активированной матрицы для связывания желатина используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные п-нитрофенилакрилатные группы в количестве 2-90 мкмодь/г матрицы. Процесс иммобилизации проводят путем инкубации матрицы с 1-3% раствором желатина в растворе бикарбоната натрия при рН 8-9.

Способ осуществляют следующим образом.

П р и м е р 1. Получение сорбента для выделения фибронектина (желатин-МПС- ПА).

В колбу, содержащую 250 мл 2% раствора желатина в 0,3 М растворе бикарбоната натрия с рН 8,5, вносят 50 г биосорбента МПС-ПА, перемешивают и инкубируют в течение суток при умеренном встряхивании, после чего в реакционную смесь добавляют 5 мл этаноламина, перемешивают и выдер: живают еще сутки. Полученный сорбент промывают физиологическим раствором, 0,05 М трис-HCI буфером рНГ7,5, содержащим 1 М NaCI и 4 М мочевину для удаления несвязавшегося желатина и уравновешивают в 0,02 М цитратном буфере рН 7,5, содержащем 0,01 М эпсилон-аминокапроновую кислоту и 1 М NaCI и используют для выделения фибронектина из бычьей плазмы. Емкость полученного сорбента составила 2,2 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 2. Синтез сорбента проводят аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют 1 % раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 3. Синтез сорбента проводят аналогично примеру 1, с тем отличием, что используют 3% раствор желатина. Получают сорбент, имеющий емкость 2,5 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Используемый диапазон концентраций желатина является оптимальным по параметру числа активированных групп, находящихся на сорбенте.

П р и м е р 4. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 8,0. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 5. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 9,0. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 2,4 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

П р и м е р 6. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 7,5. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 0,8 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Пример. Инкубацию раствора желатина с биосорбентом МПС-ПА проводят при рН 9,5. Полученный сорбент обрабатывают по примеру 1. Он имеет емкость 1,0 мг фибронектина на 1 мл сорбента.

Примере. Хроматографическое выделение фибронектина из бычьей плазмы на желатин-МПС-ПА.

На колонку размером 1x3,2 см (объем 2,5 мл), заполненную сорбентом по примеру 1, наносят со скоростью 5 мл/мин 25 мл бычьей плазмы. Колонку промывают 0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1

M NaCI и 0,01 М эпсилон-аминокапроновую кислоту до нулевого значения поглощения при 280 нм, и далее злюируют специфически сорбированный фибронектин 0,05 М трис-HCI буфером рН 7,5, содержащим 1 М NaCI и 4 М мочевину. Собирают фракции объемом 3 мл и измеряют их оптическую плотность при 280 нм. Элюат обессоливают на Сефадексе G-25, используя 0.02 М цит- ратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 М NaCI и 0,05 М трилона Б. Производительность сорбента в процессе выделения фиб- ронектина составила 0,44 мг/мл.мин.

Сравнительные характеристики сорбента, полученного заявленным способом и известным, представлены в табл.1.

Емкость и производительность сорбентов, полученных по примерам 1-8, при пропускании 25 мл бычьей плазмы со скоростью 5 мл/мин через колонку с 2,5 мл сорбента, а также выход фибронектина в данных примерах представлены в табл.2.

Из данных табл.1 и 2 следует, что при сохранении емкости и увеличении производительности сорбента, полученного по описываемому способу, по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу в 10-11 раз. выход фибронектина не уменьшается (0,22 мг/мл по описываемому способу против 0,215мг/млпо способу-прототипу).

П р и м е р 9, Препаративное выделение фибронектина из бычьей плазмы в режиме in batch.

В 1400 мл бычьей плазмы вносят 400 мл биосорбента желатин-МПС-ПА, полученного по примеру 1. Проводят сорбцию в объеме при перемешивании в течение 1 ч. Супернатант удаляют, сорбент промывают 0,02 М цитратным буфером рН 7,5, содержащим 1 М NaCI и 0,01 М зпсилон-аминокап- роновой кислоты для удаления неспецифически сорбированных белков до нулевого поглощения при 280 нм. Отмытый сорбент вносят в 400 мл 0,1 М трис-HCI буфера рН 7,5, содержащего 8 М мочевины и 2 М NaCI. Элюцию проводят в объеме в течение 15 мин. После удаления элюата вторично проводят элюцию и так до полной десорбции фибронектина с сорбента. Затем элюат обессоливают на Сефадексе G-25, используя 0,02 М цитратный буфер рН 7,0, содержащий 0,05 М NaCI и 0,05 М трилон Б.

Таким образом, полученный описьпае- мым способом сорбент может быть использован в крупномасштабном производстве фибронектинэ.

5Проведен сравнительный эксперимент

по излучению кинетики сорбции фибронектина на известном (Желатин-Силикагель) и полученном (Желатин-МПС-ПА) сорбентах. Сравнение проводила с использованием

0 100 мл бычьей плазмы и 30 мл указанных сорбентов. Результаты представлены в табл.3.

Как видно из данных табл.3, максимальная емкость известного сорбента достигает5 ся за 1 ч, тогда как описываемого сорбента - за 10 мин. Таким образом, и в batch - варианте сорбции сорбент Желатин- МПС-ПА оказывается в 10 раз производительнее, чем Желатин-Силикагель (для

0 Желатин-МПС-ПА производительность равна 2,2/10 0,22 мг/мл-мин, тогда как для Желатин-Силикагеля - 1,5/60 0,025 мг/млх Хмин).

Препарат фибронектина, полученный с

5 использованием сорбента по описываемому спосабу, характеризуется высокой гомогенностью по данным электрофореза в ПААГ. Сорбент выдерживает непрерывную эксплуатацию в течение 4 месяцев без за0 метных изменений емкости и производительности.

Таким образом, описываемый способ позволяет упростить процесс получения сорбента для выделения фибронектина за

5 счет одностадийности и исключения использования токсичных соединений и повысить производительность сорбента при сохранении его специфической емкости. Формула изобретения

0Способ получения сорбента для выделения фибронектина путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, отличающийся тем, что, с целью упрощения

5 способа и повышения производительности сорбента в процессе выделения фибронектина, в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей

0 активные n-нитрофенилакрилатные группы, в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы, в 1-3%-ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с

5 рН 8-9.

Таблица 1

Сущность изобретения: сорбент получают путем иммобилизации желатина на активированной пористой кремнеземной матрице, причем в качестве матрицы используют пористое стекло, модифицированное сшитой полиакрилатной оболочкой, содержащей активные п-нитрофенилакри- латные группы в количестве 2-90 мкмоль/г матрицы, а иммобилизацию желатина проводят путем инкубации матрицы в 1-3%- ном растворе желатина в растворе бикарбоната натрия с рН 8-9. 3 табл.

Параметры хроматографической очистки фибронектина на сорбенте по предлагаемому

способу и по способу-прототипу

Таблица 2

Таблица 3