Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ Советский патент 1988 года по МПК B01J20/26 

со

Ичпбретение относится к химии полимеров, а именно к способу получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и колла- геназ, и может быть использовано в биохимии и медицине.

Целью изобретения является повышение емкости адсорбентов по фибро- нектину и коллагеназам.

В качестве специфических лигандов в способе используются of. -цепи коллагена или oL 1СВ7 пептид, получаемый бромциановым щеплением oi. J -цепи коллагена.

Пример 1. 140 мг лиофилизо- ванного коллагена из кожи крыс растворяют в 70 мл 0,5 М уксусной кислот в течение 16 ч при 4°С. Раствор диа лизуют против 8 л 0,06 М натрий-аце- татного буфера, рН 4,8, за 16 ч при и затем нагревают при 45 С в течение 30 мин. Полученный раствор фильтруют, вводят на колонку с целлюлозной КМ-52 (2,5x23 см), уравнове- шенной 0,06 М натрий-ацетатным буфером, рН 4,8 и элюируют линейным градиентом NaCl (,1 М) в том же буфере. Смеситель для градиента двухкамерный, по 400 мл в каждой камере, общий объем - 800 мл. Хроматографию

Q

проводят при 42 С. Скорость тока 200 мл/ч. Фракции анализируют по поглощению при 230 нм. Соответствующие фракции, содержащие oi, , oi, + ft 2 ио, -компоненты, диали зуют против 0,1 М уксусной кислотой и лиофилизуют. Суммарный выход по белку 50,2% ( od| цепь - 9,52 мг, - 18,4 мг, /J „ - 7,76 мг, ,, - 22,5 мг oi., + /Ь„ - 12,09 мг).

Лиофилизованные ,- или /3, - фрагменты (по 180 мг) растворяют в 40 мл 70% меравьиной кислоты и инкубируют 4 ч при 37 С под азотом с 0,5 г BrCN. Затем смесь вводят на колонку с сефадексом С-25 (1,8 х X 60 см), уравновешенным 0,1 М уксусной кислотой. Скорость тока 45 мл/ч. Фракцию, выходящую с исключающим объемом колонки, лиофилизуют и получают 165 мг смеси бромциановьгх пептидов odi -цепи коллагена. Получено 7,5 мг oi 1 СВ7-пептида коллагена

Лиофилизованный oL 1СВ7-пептид коллагена (20 мг) растворяют в 10мл 0,1 М NaHCOj, рН 8,4, содержащего 0,15 М NaCl, добавляют 10 мл бром- циан-активированной сефарозы 4В и

0

5

0 5 0

5 0

5 ..

5

суспензию перемешивают в течение 16 ч при 4 С. Затем сорбент промывают 50 мл того же буфера, 50 мл воды и перемешивают 2 ч при 20 С с- 10 мл 1 М раствора этаноламина, оттитрованного 6 н. НС1 до рН 9. Сорбент отделяют и промывают по 50 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера с 1 М NaCl, рН 4,5 и 0,1 М натрий-борат- ного буфера с 1 М NaCl, рН 9,0 (операцию повторяют трижды). Затем сорбент промывают водой и хранят в виде суспензии в воде при 4 с в присутствии 0,02% азида натрия.

Количество присоединенного od, 1СВ7- пептида определяют по содержанию ок- сипролина в гидролизате аликвоты адсорбента.

Примеры 2-9. Аналогично получают адсорбенты на основе сефа- розы 4В или CL-4B, сферона 1000 и тойопала HW-65 с oi, - и о Цепями, и /3,2 -компонентами, oi 1СВ8- бромциановым пептидом и желатином.

Свойства полученных сорбентов представлены в таблице.

Пример 10. Кбг силикагеля МСА-750 добавляют 35 мл толуола и 2,5 мл 3-(2,3-эпоксипропокси)пропил- триметоксисилана, вакуумируют на роторном испарителе 5 мин и кипятят при перемешивании 10 ч при 110 С. Сорбент промывают на фильтре 70 мл толуола, 140 мл ацетона и высушивают. К полученному продукту добавляют 167 мл 0,1 Н.НС1 в ацетоне и перемешивают 2 ч при 20 с. Сорбент промывают 100 мл воды до рН 7 промывных вод и сушат в вакууме при 80°С.

Полученный сорбент суспендируют в растворе 0,256 г периодата натрия в 200 мл воды и перемешивают в течение 1 ч при 20°С. Затем сорбент промывают 300 мл воды и перемешивают в течение 16 ч при 20°С с раствором 100 мг оС, -цепи в 50 мл воды, после чего продукт промывают 100 мл воды, суспендируют в 50 мл 0,1 М бикарбо- натного буфера, рН 8,5, добавляют 0,05 г бромгидрида натрия и перемешивают в течение 1 ч при 20°С. Полученный адсорбент промывают 50 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера, рН 4,5, содержащего 1 М NaCl, и 50 мл 0,1 М натрий-боратного буфера, рН 9,0, содержащего 1 М NaCl (операцию повторяют трижды). Затем сорбент промывают водой и хранят при 4 С.

3U19717

Свойства адсорбента приведены в

10 а

таблице.

Пример 11. (Хроматография фибронектина плазмы крови человека на адсорбентах, содержащих фрагменты молекулы коллагена) .

Инкубируют 1 ч при 20 С раствор плазмы крови человека (лиофилизован- ную плазму из 60 мл крови растворяют в 30 мл 0,05 М трис-буфера, рН7,4, с 0,15 М NaCl, 0,5 мМ PMSF и 0,02% азида натрия) с 10 мл oi, -сефаро- зы 4В. Затем адсорбент упаковывают в силиконизированную стеклянную колонку, которую промывают тем же буферным раствором до отсутствия поглощения при 280 нм в элюате. После этого колонку промывают уравновешивающим буферным раствором, содержащи 1 М мочевину (50 мл), и вымывают фиб ронектин тем же буфером с 4 М мочевиной (14 мл). В заключение колонку промывают тем же буфером с 8 М мочевиной. Функции анализируют по поглощению при 280 нм. Фракции, содержащи фибронектин, диализуют против 0,1 М уксусной кислоты и лиофилизуют. Выхо фибронектина 17 мг (94,4%). Чистота полученного препарата подтверждена . данными электрофореза в полиакрила- мидном геле в присутствии додецил- сульфата натрия.

Пример 12. (Хроматография коллагеназы из культуральной среды фибробластов кожи человека на о(,1СВ7-сефарозе) .

А. Коллагеназу выделяют из 5 л среды осаждением сульфатом аммония (60% насьпцения). В случае бессыворо- точной среды осаждение проводят в присутствии сывороточного альбумина в концентрации 0,5%. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,01 М трис-HCl буфере, рН 7,5, содержанием 0,001 М CaCl2, и после диализа против этого же буфера раствор, содержащий 300 мг белка, вводят на колонку с КМ-целлюлозой, уравновешенной тем же буфером, Элюцию коллагеназы проводят градиентом NaCl (,3 М) в 0,01 М трис-НС буфере, рН 7,5, с 0,001 М CaCl2Co ско- ростью тока 0,1 мл/мин. Степень очистки на стадии ионообменной хроматографии - 30 раз. Полученный препарат коллагеназы используют далее для аффинной хроматографии. Коллагеназную активность определяют по гидролизу с -коллагена.

Б. Сорбент об1СВ7-сефароза (5 мл упакованного объема) инкубируют 1 ч при 4°С с раствором 10 мг препарата коллагеназы, полученной в п.А, в

10 мл 0,05 М трис-НС буфера, рН7,4, содержащего 0,1 М NaCl, 0,001 М СаСЦ, 0,005 М PMSF и 0,05% Brij 35.

Затем сорбент упаковывают в колонку (1,2 X 4 см), которую промывают при 4 С по 25 нп буфера А, буфера А с 1 М NaCl, 0,05 М натрий-ацетатного буфера, рН 5,2, содержащего 0,2 М NaCl,

0,001 CaClj, 0,005 М PMSF и 0,05% Brij 3. Хроматографию проводят при скорости тока 20 мл/ч, объем фракций - 1 мл. Фракции анализируют по поглощению при 280 нм и по коллагеназной активности. Коллагенолитичес- кая активность распределялась в двух фракциях, элюированных буфером А, содержащим 1 М NaCl, и натрий-ацетатным буфером. Выход по активности 40%,

степень очистки 10 раз.

Формула изобретения

Способ получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимого носителя и последующего ковалентного связывания его со специфическим лигандом, отличающий- с я тем, что, с целью повьппения емкости адсорбентов по фибронектину и колла- геназам, в качестве специфического лиганда используют oi -цепи молекулы коллагена иои ot 1СВ7-бромциановый пептид коллагена.

514197176

Свойства адсорбентов с иммобилизованными фрагментами молекулы

коллагена

Изобретение относится к химии полимеров и позволяет получать биоспецифические адсорбенты для выделения фибронектина и коллагеназ, имеющие емкость по выделяемым веществам 2,0-2,6 мг/мг лиганда. Это достигается использованием в способе получения биоспецифических адсорбентов для выделения фибронектина и коллагеназ путем активирования нерастворимой матрицы и последующего кова- лентного связывания ее со специфическим лигандом фрагментов oL -цепи молекулы коллагена или об 1СВ7-бром- цианового пептида коллагена в качестве лигандов. 1 табл. а «е (Л

т, /

в мг/г сухого веса матрицы