-
Ё
Изобретение относится к способу получения полипептида со свойствами человеческого фактора некроза опухо- ли (ФНО). Способ получения ФИО предполагает культивирование штаммов бактерий Escherichia coli, трансформированных рекомбинантными плазмидными ДНК рНТТ 26, или pHTR91, или PHTS115, или PHTS37, или рНТКРЗ, или рНТКШ, кодирующими ФНО в LB бу льоне, модифицированной М-9 среде или TG среде,выделяют продукт, а потом очищают его путем нанесения на колонку с ДЕАЕ-сефарозой с обессоливанием, ультрафильтрацией, изоэлектрофокуси- рующим гель-электрофорезом с после- -дующей ультрафильтрацией и гель- фильтрацией на колонке с Био-гелем.
Изобретение относится к способу получения полипептида со свойствами человеческого фактора некроза опухоли, который может быть использован в качестве противоопухолевых агентов, так как обладает селективной цито- токсической активностью по отношению к опухолевым клеткам и регрессирует, опухоли у животных.
Пример 1,
Человеческие альвеолярные макрофаги собирают бронхоальвеолярным промыванием с помощью фасфатно-солевого буфера. Альвеолярные макрофаги, 6,3 I07 клеток, суспендируют в среде RPM1-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) при концентрации клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа Через 1 ч культивирования эндотоксин (липополисаха- рид, полученный из E,coli), TPA (фор- бол-1-миристат-13-ацетат) и цикло- ; гексимид ( ингибитор синтеза белка) добавляют до концентраций соответст-. венно 10 мкг/мл, 10 нг/ мл и 1 мкг/мп После этого культивирование продолжают 4,0 - 4,5 ч (общее время 5,0 - 5,4 ч). Культуральную среду удаляют и макрофаги лизируют и гомогеннаи- -, руют в 5 М гуанидилтиоцианатном растворе, содержащем 0,6% N-лауроилсарко- зината натрия и 6 мМ нитрата натриял
VJ Ы О 00 СЯ (Л
OJ
Гомогенат центрифугируют в градиенте хлористого цезия, содержащем 0,1 М ЭДТА. Осадок растворяют в небольшом I количестве 7 М раствора, мочевины, содержащего 0,35 М NaCl 20 мм трис- НС1 (рН 7,4) и 20 мм ЭДТА, и осаждают этанолом. Получают 159 мкг общей РНК.
Фракцию общей РНК растворяют в .1 мл 10 мМ трис-HCl (рИ 7,4) буфера, содержащего 1 мМ ЭДТА (ТЭ-раствор), и npoi-ревают при 65°С в течение 5 мино Добавляют раствор хлористого натрия до концентрации 0,5 М и раствор наносят на колонку с олиго(дТ)- целлюлозой, предварительно уравно- вешенной ТЭ-раствором, содержащим 0,5 М хлористый натрий. Поли(А)-и-РНК элюйруют из колонки с помощью ТЭ- раствора и получают 8 мкг РНК«
Поли(А)-и-РНК растворяют в концентрации 1,9 нг/мл в дистиллированной воде и раствор инъецируют в ооци- ты Xenopus laevis в дозе приблизи- - тельно 50 мл на ооцит. Десять ооци- тов инкубируют в 100 мкл среды Barth при в течение 24 ч. Ооциты гомогенизируют и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Сус- пернатант подвергают анализу на ФНО- активность определением цитотоксичес- кой активности ho отношению к клеткам L-929 мыши.
Для этого образец (0,1 мл) серийно разбавляют указанной ниже средой и в каждую лунку 96-луночного планшета прибавляют 0,1 мл суспензии клеток L-929 (5х10 клеток/мл), содержащей актиномицин D (2 мкг/мл). Используют4 минимальную питательную среду Eagle, содержащую 1% эмбриональной бычьей сыворотки. Пластинку инкубируют при 38,5°С в течение 18 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа.
Определение числа жизнеспособных клеток L-929 м оценку биологической активности проводят следующим образом. После инкубирования прибавляют 20 мкл 25%-ного глутаральдегида для фиксирования жизнеспособных клеток, затем промывают и сушат. После этого для окрашивания фиксированных клеток прибавляют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленового голубого. Избыток мети- ленового голубого отмывают и пластинки сушат. Метиленовый голубой, связавшийся с фиксированными клетками,
10
9855
элюйруют 200 мкл 0,36 н„НС1 и измеряют его поглощение при 665 нм.
Поглощение пропорционально числу жизнеспособных клеток. Концентрация требуемая для умерщвления 50% клеток L-M, приравнивается к 1 ед активности/мл о Цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-M, определенную в указанных выше условиях, выражают как единицы (LM) для того, чтобы отличать от цитоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-929 - клеткам-мишеням.
Супернатант, полученньй выше, обладает цитотоксической активностью 6,6 ед. (Ь-929)/мл. Это указывает на то, что образец поли(А)-и-РНК содержит и-РНК ФИО.
Комплементарную ДНК синтезируют с использованием полученной в разделе 1 поли(А)-и-РНК в качестве матрицы.
15
20
0
5
0
5
0
5
6 мкг поли(А)-и-РНК растворяют в 40 мкл буфера 50 мМ трис-HCl (рН 8,3), содержащего 10 мМ MgCl2, 10 мМ ди- тиотреитола, 4 мМ пирофосфата натрия, 1,25 мМ каждого из трех дезоксирибо- нуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ и дТТФ, 0,5 мМ дЦТФ, 167 нМ альфа-з2Р- дЦТФ (удельная радиоактивность 3000 Ки/ммоль), 4 мкг олиго(дТ)1г„(4 и 120 ед. обратной транскриптазы, полученной из вируса птичьего миело- бластоза (ВПМ), и инкубируют при 43 С в течение 30 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТА„ Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) и к водной фазе прибавляют ацетат аммония до концентрации 2,5 М. Гибрид к-ДНК-и-РНК выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Осадок гидрида к-ДНК-и-РНК растворяют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,5), содержащего 5 мМ MgClfc, 10 мМ сульфата аммония, 100 мМ хлористого калия, 0,15 мМ бетаникоти- намидадениндинуклеотида, 5 мкг бычьеч- го сывороточного альбумина, 0,04 мМ каждого из четырех дезоксирибонуклео- тидтрифосфатов дГТФ, дАТФ, дТТФ и дЦТФ, 0,9 ед. рибонуклеазы НЕ.со11, 23 ед. ДНК-полимеразы 11, и кубируют при 12°С в течение 60 мин, а затем еще в течение 60 мин при.22°С для синтеза к-ДНК, Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА, экстрагируют
«
смесью фенол/хлороформ и выделяют осаждением этанолом
к-ДНК, полученную выше, растворяют в 100 мМ буферного раствора какодила- та натрия (рИ 7,2), содержащего 2 мМ СаС12, 0,2 мМ дитиотреитола, 0,1 мМ альфа- 2Р-дЦТФ (удельная радиоактивность 3 Ки/ммоль), 10 ед. терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин.
Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА, к-ДНК экстрагируют смесь фенол/ /хлороформ и осаждают этанолом. к-ДНК, оканчивающуюся олиго(дЦ), растворяют в 10 мМ буфере трис-НС1 (рИ 7,4), содержащем 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлористого натрия, до концентрации к-ДНК, оканчивающейся олиго(дЦ) равной 2 мкг/мл.
10 мкг ДНК pBR322 растворяют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,4), содержащего 10 мМ хлористого магния, 50 мМ сульфата аммония, 10 мкг бычьего сывороточного альбумина, и прибавляют 15 ед рестрик- ционной эндонуклеазы Pstl. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол/хлороформ и выделяют ДНК из водной фазы осаждением этанолом. Полученную ДНК растворяют в 200 мкл такого же буферного раствора, который был использован для присоединения к окончанию к-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 едо терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и Н-дГТФ вместо
Р-дЦТФ), и инкубируют при 37°С в течение 20 мин, осуществляя присоединение приблизительно 10 - 15 остатков дезоксигуаниловой кислоты (дГ) к 3 -окончанию. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и ДНК pBR3-22, оканчивающуюся олиго (дГ), выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую ДНК pBR322 с присоединенными окончаниями растворяют в том же буфере, которьй был использован для растворения олиго(дЦ) концевой к-ДНК таким образом, чтобы результирующая концентрация ДНК pBR322 с присоединенными окончаниями была равна 20 мкг/мл.
0
120 мкл раствора олиго (дЦ)-конце-1 вой к-ДНК смешивают с равным объемом раствора олиго(дГ)-концевой ДНК pBR322, инкубируют при 65°С в течение 5 мин и при 57°С в течение 120 мин для достижения ренатурации. 6. Отбор организмов-хозяев о Полученными ллазмидами трансформируют клетки штамма E.coli X 1776, культивируют при 37°С в 20 мл L-бульо- на (состав: 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия и 1г глюкозы на 1 л, рН 7,2), содержащего 100 мкг/мл диаминопимели- новой кислоты и 40 мкг/мл тимидина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при 600 нм, не достигнет 0,5. Клетки собирают центрифугированием при 4 С, промывают 10 мл 10 мМ буфера трис-HCl (рН 7,3), содержащего 50 мМ хлористого кальция. Клетки снова суспендируют в 2 мл того же буферного раствора и инкубируют при 0°С в течение 5 мин. К 0,2 мл 5 суспензии прибавляют О,1 мл раствора рекомбинантных плазмид, полученного выше, инкубируют при 0°С в течение
5
0
0
5
0
0
5
15 мин, выдерживают при 42°С в течение 2 мин, добавляют €,5 мл L-бульона с добавками и культивируют при встряхивании в течение 1 ч. Отбирают аликвоту культуры, наносят на пластинку агара с L-бульном, содержащим добавки и тетрациклин в концентрации 15 мкг/мл, и культивируют при 37°С в течение 12ч. Набор к-ДНК получают отбором трансформированных клеток, устойчивых к тетрациклину.
Трансформированные клетки, включающие в себя рекомбинантные плазми- ды, содержащие к-ДНК, кодирующую по- липептид человеческого ФНО, отбирают гибридизационным анализом,
к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО, выделяют из рекомбинантной плазмиды pRTNF802 (как показано в справочном примере 7), расщепляют эндонуклеазой Ava I или На« II, фрагменты ДНК выделяют осаждением этанолом и электрофорезом в полиакриламидном геле.
Фрагмент ДНК (299 п„о), соответствующий основаниям от 285 до 583, получают расщеплением эндонуклеазой Ava I (Av.a I-фрагмент)
Другой фрагмент ДНК (88 п.о-), соответствующий основаниям от 33 до 120, получают расщеплением эндонуклеазой Нае II (Нае II-фрагмент). Ava I-фрагмент и Нае II-фрагмент метят радиоактивной меткой Р„ Эти меченые фрагменты ДНК используют в качестве пробы для проверки набора к-ДНК и отбора трансформированных клеток, имеющих плазмиду, содержащую к-ДНК, кодирующую полипептид человеческого ФИО.
С использованием 2Т-меченого Ava I-фрагмента в качестве пробы при rtepBOM отборе из 20000 клоновг и отбирают 43 клона. Эти 43 выбранных клона подвергают второму отбору с использованием 32Р-меченого Нае II- фрагмента и отбирают 6 клонов, имеющих сильные гибридизационные сигналы на оба фрагмента к-ДНК ФИО кролика.
ДНК выделяют из 6 клонов, отобранных в разделе 7, а именно плазмиды pIITNFl, pHTNF4, pHTNFS, pHTNFU, pHTNF22 и pHTNF260 Каждую из рекомби- натных плазмид вводят в клетки E.coli НВ101, культивируют в 50 мл LB-бульо- на (составг 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г хлористого натрия на 1 л, рН 7,5) до тех пор, пока мутность культуры, измеряемая при 600 нм, не достигнет 0,8 После этого собирают приблизительно (3-5) хЮ10 клеток, суспендируют в 50 мМ буфера трис-HCl (рН 8,0), содержащего 0,15 лнзоцима и 30 мМ NaCl. После инкубации в течение 30 мин в .. ледяной воде клетки подвергают лизису шестикратным замораживанием-размора- живанием. Клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный лиэат. Лизат, полученный из каждого трансформированного организма, подвергают анализу на цитотокси- ческую активность по отношению к . клеткам L-929.
Лизат, полученный из трансформированного организма, содержащего плазмиду pHTNF13, имеет цитотоксичес- кую активность 186,1 ед. (Ь-929)/мл.
Рекомбинантную плазмиду pHTNF13 выделяют так, как описано выше,, Плаз- мидную ДНК расщепляют с помощью эн- донуклеаэы Pst I, клонируют к-ДНК , После этог фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют различными рестрик- ционными эндонуклеазами и последовательности оснований результирующих 16
o
5
0
5
фрагментов определяют по методике Maxac-Gilberc.
Участок, кодирующий полипоптид человеческого ФИО, определен на основе гемологичности к последовательности оснований, кодирующей кроличий ФИО,
ДНК, кодирующая полипептид человеческого ФИО, кодирует его полипептид-предшественник, состоящий из 233 аминокислотных остатков. Полный полипептид человеческого ФИО представляет собой полипептид, соответствующий 155 аминокислотным остаткам от С-конца его предшественника, который кодируется последовательностью оснований от } 235 до № 699. Последний кодон, кодирующий полипептид человеческого ФИО, представляет собой кодон TGA.
Иммунологическую перекрестную реакционную способность полипептида человеческого ФИО лизата определяют с помощью антитела против кроличьего г плазменного ФИО следующим образом.
Лизат смешивают с равным объемом разбавленного в 100 раз очищенного антитела против кроличьего плазменного ФИО, полученного в справочном примере. После инкубирования при 37ЯЗ в течение 2 ч цитотоксическую активность реакционной смеси измеряют по методике, описанной выше, с использованием клеток L-929 в качестве кле- 5 ток-мишеней. Кроличий плазменный ФНО, полученный в справочном примере, предварительно разбавляют фосфатным солевым буфером и разбавленный раствор используют в качестве контрольного ® образца ФНО. Цитотоксическая активность полипептида человеческого ФНО не нейтрализуется антителом,
П р и м е р 2, Получение полипепг тида человеческого ФНО в Escherichia
5 coll.
к-ДНК выделяют из рекомбинантной
0 плазмиды pHTHF13 так , как указано в примере 1, расщепляют с помощью эн- донуклеаэы. Eco RI для отщепления части некодирующего участка ниже участка, кодирующего ФНО. Результи5 рующий фрагмент ДНК (приблизительно 1,1 к.д.о.) вводят в больший фрагмент ДНК плазмиды pBR322 по Pst I и Eco RI и конструируют рекомбинант- ную плазмиду, включающую в себя к-ДНК
0
ФИО и ген устойчивости к тетрациклину (плазмида рНТ113).
Экспрессивная плазмида рВТТ26 кодирует полный полипептид человеческого ФИО.
к-ДНК, выделенную из рНТ113, расщепляют эндонуклеазами Ava I и Hind III и фрагмент ДНК размером 578 ., включающий большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого ФИО (называемый ЧФНО-фраг- мент), выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
Фрагмент ДНК, содержащий промотор tac, выделяют из плазмиды pDR 540/P-L растворением в 2 мл 0,10 мМ буфера трис-HCl (рН 7,5), содержащего 50 мМ NaCl, 6 мМ MgClg и 6 мМ 2-меркапто- этанола, и расщеплением эндонуклеазами EcoRI и Bam H1 при 37 С в течение 60 мин После добавления хлористого натрия до результирующей концентрации О,3 М отщепленные фрагменты ДНК осаждают этанолом Фрагмент ДНК, содержащий промотор пае, выделяют электрофорезом в полиакриламидном геле с выходом 8,3 мкг.
Фрагмент промотора tac связывают с химически синтезированным олигодез- оксирибонуклеотидным адаптером, представленными следующей формулой:
5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC
3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT
Этот адаптер включает инициирующий кодон АТС и последовательность оснований, соответствующую 5 -концевой части последовательности оснований, кодирующей полный полипептид человеческого ФИО, и имеет Bam HI- и Ava.I- когезивные концы. Результирующий фрагмент ДИК называют сас-промотор- адапторным фрагментом.
Отдельно больший фрагмент ДНК (размером 4,3 т.п.о.), включающий ген устойчивости к ампициллину (фрагмент рВК322-Амп) вырезают из плазмиды pBR322 расщеплением эндонуклеазами Hind III и Ecu RI, и выделяют гель- электрофорезом в 0,7%-ном агарозе с низкотемпературным размягчением,
1 мкг ЧФНО-фрагмента и 6 мкг фрагмента рВК322-Амп растворяют в 66 мМ буфере трис-UCl (рН 7,6), содержащем 6,6 мМ хлористого магния, инкубируют при 55 С в течение 10 мин, прибавляют АТФ и дитиотреитол соответственно до концентрации 1 и 10 мМ и 168 ед. Т ДНК-лигазы и смесь инкуби10
«5
0
5
0
5
0
5
0
руют при 22°С в течение 120 мий, Результирующий фрагмент ДНК выделяют экстракцией фенолом. Получают приблизительно 4 мкг ДНК. Фрагмент ДНК (0,8 мкг) связывают с сас-промотор- адапторным фрагментом (0,3 мкг) в тех же условиях, как описано выше, за исключением того, что используют 63 ед. Т ДНК-лигазы. Реакционную смесь разбавляют в 6 раз дистиллированной водой и смешивают с равным объемом суспензии клеток Eocoli IM103, обработанных кальцием. Смесь последовательно инкубируют в ледяной воде в течение 20 мин, при 42 С в течение 1 мин и при комнатной температуре в течение 10 мин, прибавляют бульон LB, встряхивают при 37 С в течение 60 мин. Аликвоту результирующей клеточной суспензии наносят на LB-ara- ровые пластинки, содержащие ампициллин в концентрации 25 мкг/мл, и культивируют в течение ночи при 37 С. Отбирают колонии, устойчивые к ампициллину.
Один из трансформированных организмов, способный вырабатывать полипептид человеческого ФНО, называют 1М103/рНТТ26.
Обработанные кальцием клетки E.coli IM103 получают следующим образом Клетки E.coli IM103 высевают в LB бульон и культивируют при 37°С в течение ночи. 1 мл результирующей культуры высевают в 100 мл LB-бульона и дополнительно культивируют при 37 С до тех пор, пока мутность культуры, определяемая при 650 нм, не достигнет 0,6. После инкубации в течение 30 мин в ледяной воде клетки собирают центрифугированием и суспендируют в 50 мл 50 мМ раствора хлористого кальция, выдерживают при 0°С в течение 60 мин, собирают центрифугированием и снова суспендируют в 10 мл 50 мМ раствора хлористого кальция, содержащего 20% глицерина. Эту суспензию используют в качестве обработанной кальцием суспензии клеток E.coli IM103. Трансформированный организм Ш103/рНТТ26 культивируют в течение ночи в бульоне LB при 37°С. Культуру (0,5 мл) высевают в 5 мл свежего бульона LB, культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавляют изопропил- бета-В-тиогалактозид до концентрации 1 мМ и культивирование продолжают еще в течение 4 ч. Клетки собирают
11- 17
и суспендируют в 1 мл 50 мК буфера трис-HCl (рН 8,0), содержащего 0,1% лизоцима и 30 мМ NaCl, и оставляют стоять при 0°С в течение 30 мин, После этого шесть раз повторяют замораживание в смеси сухой лед/этанол и размораживание при 37°С, клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный лизат.
Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 99000 ед„ (L-929)/ /мл, которая не нейтрализуется антителом против кроличьего ФНО„ Это подтверждает тот факт, что полипептид человеческого ФИО иммунологичес- ки не пересекается с кроличьим ФИО.
Рекомбинантную плазмиду рНТ113 гид- ролизуют эндонуклеазами Ava I и Sal I для расщепления на 3 фрагмента (размерами 0,8, 1,3 - 2,6 к.п.о.) Фрагмент 1,3 к.п.о.-ДНК, включающий в себя большую часть участка, кодирующего полный полипептид человеческого ФНО и часть гена устойчивости к тетрациклину, .выделяют -(обозначают Ava I- Sal I-фрагмент). Ava I- Sal I-фраг- мент связывают со следующим химически синтезированным олигодезокеирибонук- леотидным адаптером. Этот адаптер
обозначают как адаптер I:
5 -CGATATGTCATCTTCTCGAACC
3 -TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT
Результирующий фрагмент ДНК обоз- начают как ЧФНО-адапторный фрагменте
Отдельно фрагмент ДНК (35-п.о.), включающий в себя часть участка промотора trp, отрезают от плазмиды pDR720/P-L расщеплением эндонуклеаза- ми Eco RI и Нра I, и фрагмент ДНК связывают с химически синтезированным адаптером, имеющим следующую формулу:
5 -AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTA
3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCAT
Связанный фрагмент ДНК обозначают как фрагмент промотора сгр.
Йлазмиду pBR322 расщепляют нуклеазами Eco RI и Sal I, выделяют больший фрагмент ДНК (размером 3,7 т.п.о.). Последовательным связыванием этих трех фрагментов ДНК, фрагмента ЧФНО-адаптора, фрагмента промотора сгр и большего фрагмента-pBR322 :. конструируют экспрессивную плаэмиду pHTR91. Экспрессивную плазмиду вводят в клетки E.coli HB101 способом, описанным в разделе 1, и один из
o
855
5
0
5
0
12
трансформированных организмов называют HB101/pHTR91o
Трансформированный организм HB101/pHTR91 культивируют в течение ночи при 37 С в модифицированной среде М-9 (состав: 0,7% NazHPO, 12% HfcO, 0,3% , 0,05% NaCl,
В
ч
5
0
C
0,1% , 2 мг/мл витамина 0,45% казаминовой кислоты, 1 мМ MgS04, 0,1 мМ СаС12 и 0,5% глюкозы)., Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же среды и культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавляют 3-бета- индолакриловую кислоту до концентрации 20 мкг/мл, культивируют в течение 4 ч. Клетки собирают, обрабатывают по методике, описанной в разделе 1 , и получают просветленньй лизат,
Лизат имеет цитотоксическую активность 1,01х10б ед. (Ь-929)/мл„
Фрагмент Ava I- Sal I, полученный в разделе 2, связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидным адаптером, имеющим следующую последовательность:
5 -GATCCATGTCATCTTCTCGAACC
3 -GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT
Связанный фрагмент ДНК расщепляют эндонуклеазой Bam HI и получают фрагмент ДНК, имеющий на обоих окончаниях когезивные концы Bam HI (фрагмент ЧФНО-ТетУ. Bam HI).
Отдельно в плазмиду pSN5182, содержащую ген phos, расщепляют эндонуклеазами Нра I и Eco RI и получают фрагмент ДНК (размером 4 т.п.о.), включающий участок промотора phos и последовательность Shine-Daigarпо, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид, N-концевую часть фосфатсвяэывающего белка, а также ген устойчивости к тетрациклину.
Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент Нра I - Eco RI0 Фрагмент Нра I - Eco RI связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидом-связывателем, имеющим следующую последовательность:
5J-CCCGGATCCGGG
3 -GGGCCTAGGCCC
После этого связанный фрагмент ДНК расщепляют рестрикционной эндонуклеазой Bam HI. Результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 3,6 т. ПоО.), имеющий когезивные концы
13
Вага III в обоих окончаниях, обозначают как phos - Bam Ш.Тет.
и
Фрагмент ЧФНО-Тет . Bam HI связывают с фрагментом промотор phos - Ваш Ш.Тет и конструируют экспрессивную плазмиду для получения полипептида человеческого ФИО, связанног со связывающим фосфат белком, котору называют pHTS115. Экспрессивную плазмиду вводят в Eocoli HB101 по описанной методике.
Один из трансформированных организмов (НВ101/pHTSI15) культивируют в 5 мл среды TG (состав: 120 мМ буфер трис-HCl (рН 7,4), 0,2% глюкозы, 80 мМ NaCl, 20 мМ КС1, 20 мМ , 3 мМ , 1 мМ MgClfc, 0,2 мМ СаС1г 200 мМ FeClj, 20 мг/л лейцина, 20 мг/л пролина и 10 мг/л витамина В{), в которой присутствует . в концентрации 0,64 мМ, при 37°С в течение 20 ч при в стряхивании„ Клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 2 мл среды TG, содержащей . в концентрации 0,064 мМ, культивируют при в течение 6 ч, центрифугируют и промывают 1 мл 10 м буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащего 30 мМ NaCl. После этого их снова суспендируют в 0,2 мл 33 мМ буфер трис-HCl (рН 7,2) и смешивают с равным объемом 33 мМ буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 40% сахарозы, инкубируют при 37°С в течение 10 мин, клетки собирают, сно ва суспендируют в 0,4 мл охлажденног 0,5 мМ раствора MgCl и оставляют стоять в ледяной воде в течение 10 мин при периодическом встряхивании. Клеточные остатки удаляют центрифугированием и получают просветленный экстракт (далее обозначается как периплазмический экстракт).
Периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность 1,34МО5 ед. (Ь-929)/мл.
Мол.м. полипептида, имеющего цитотоксическую активность, определенная электрофорезом в полиакриламидном геле (12,5%) с додецилсульфатом натрия, равна 19000 дальтон, и это свиде
тельствует о том, что полипептид получается в вид« соединенного белка.
Рекомбинантную плазмидную ДНК PHTNF13 расщепляют эндонуклеазой Pst I для вырезывания фрагмента ДНК (приб35
398551
лизительно 1,2 т.п.о,), включающего ДНК человеческого ФИО. Фрагмент ДНК ДНК человеческого ФИО. Фрагмент ДНК рас5 щепляют эндонуклеазой ВЬе I и полу- чают фрагмент ДНК (приблизительно 0,9 т.ПоО. (далее обозначается как фрагмент Bbe I - Pst I) 6 мкг фрагмента Bbe I - Psc I растворяют в
10 80 мкл 20 мМ буфера трис-ИС1 (рН
8,0), содержащего 12 мМ CaCl, 12 мМ MgCl2, 0,2 М NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,02 ед. экзонуклеазы Bal 31, инкубируют при 300°С в течение 30 мин для от15 щепления приблизительно 50 - 150 пар оснований с каждого конца фрагмента
ДНК. Затем концы фрагмента снова наращивают инкубированием при 37 С в
течение 60 мин с 10 ед. ДНК-полиме- разы I EoColi (большой фрагмент) в присутствии каждого из четырех дез- оксирибонуклеотидтрифосфатов дГТФ, дАТФ, дЦТФ и дТТФ, взялых в концентрации 0,1 мМ, и 50 Mkr/мл бычьего
сывороточного альбумина о Полученный фрагмент ДНК расщепляют эндонуклеа- RI и результирующий фрагмент ДНК (приблизительно 750 п.о„), имею- - щий тупой конец и Eco RI - липкий конец, выделяют (обозначают как Bal 31-Есо RI-фрагмент).
Bal 31-Есо RI-фрагмент связывают с фрагментом Нра I-Eco RI (приблизительно 4 т.п.о о), полученным из pSN 5182 так, как описано в разделе 3, и конструируют плазмиду, содержащую участок промотора phos, последовательность Shine - Dalgano, последовательность ДНК, кодирующую сигнальный пептид и N-концевую часть фосфат- связывающего белка, последовательность ДНК, кодирующую полный полипептид человеческого ФИО и часть его полипептида-предшественника о
Плазмиду называют pHTS 37 и вводят ее в E.coli HB101 с получением трансформанта HB101/pHTS 37. Трансформированный организм HB101/pHTS 37 культивируют и периплазмический экстракт получают в условиях, описанных в разделе 3,
Полученный периплазмический экстракт имеет цитотоксическую активность, равную 4, ед. (L-929)/ /мл.
Экстракт подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле (12,5%) с додецилсульфатом натрия. Электрофорез проводят при 35 В в течение 12 ч с
использованием трис-глицинового(рН 8,3) буфера, содержащего 0,1% доде- цильсульфата натрия Белок окрашиваю Кумасси бриллиантовым голубым. Две полосы белка, не наблюдавшиеся в экстракте E.coli HB101, наблюдаются в положениях, соответствующих 22000 и 16500 дальтон. Гель нарезают на кусочки шириной 2 мм и каждый кусочек геля инкубируют в минимальной J питательной среде Eagle, содержащей 1% зародышевой бычьей сыворотки, при 4°С в течение ночи, для элюиро- вания белка из геля. Элюат используют для определения цитотоксической активности по отношению к мышиным клеткам L-929. В результате устанавливают, что сильная цитотоксическая активность наблюдается в элюате, соответствующем белку с мол,Мо 16500 дальтон.
Исходя из структуры экспрессивной плазмиды pHTS 37 делают вывод о том, что полипептид человеческого ФИО, полученный в трансформированном организме, представляет собой слитый белок, включающий часть фосфатсвя- эывающего белка и полипептид человеческого ФИО с частью его предшественника. Теоретическая мол.м. слитого белка рассчитана-и равна приблизительно 23000 дальтоно С другой стороны, мол.м. полного полипептида человеческого ФИО равна 17097 дальтон. Это исследование свидетельствует о том, что получаемый слитый белок может быть превращен в полньй полипептид человеческого ФИО в клетке-хозяи не путем ограниченного гидролиза, возможно по специфическому участку (Arg-Ser), соединяющему полный полипептид человеческого ФИО с частью ег предшественника„
Если Периплазмический экстракт инкубировать с 5 мкг/мл трипсина при 37°С в течение 1 ч и реакционную смесь подвергнуть электрофорезу на полиакриламидном геле с додецилсуль- фатом натрия в описанных выше условиях, то наблюдается белковая полоса соответствующая мол.м. около 2200 дальтон, которая может представлять собой слитый белок, исчезающий при расщепляющем действии трипсина.
ПримерЗ. Получение модифи- цированного полипептида человеческого ФИО.
0
5
5
O
5
37°С
5
Плазмиду pHTRD 4, содержащую ДНК, кодирующую полипептид, получающийся В результате отщепления четырех аминокислот из N-окончания полного поли- пепогида человеческого ФИО, конструируют таким же образом, как и экспрессивную плазмиду pHTR 91 в примере 2 (2), за исключением того, что исполь- Q зуют следующий синтетический адаптер:
5 -CGATATCACC
З1 -TATACTGGGGCT
Плазмиду pHTRD4 вводят в E«coli НВ101, трансформированный организм 5 культивируют в течение ночи при
в модифицированной среде М-9, высевают в 5 мл той же среды, культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавляют 3-бета-индолакриловую кислоту до 0 концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи. Клетки собирают центрифугированием, обрабатывают по методике, описанной в примере 2 (1), и получают просветленный лизат.
Лизат имеет цитотоксическую активность 1,. (Ь-929)/мл.
П р и м е р 4 оПолучение полипептида-предшественника человеческого ФИО в Escherichia coli.
Плазмиду рНТКРЗ, содержащую к-ДНК, кодирующую полипептид-предшественник человеческого ФИО, конструируют следующим образом. к-ДНК выделяют из ре- комбинантной плазмиды рНТ113 расщеплением эндонуклеазами Pst I и Hind III. Фрагмент к-ДНК затем дополнительно частично расщепляют эндонук- . леазой Hgi AI с получением фрагмента ft ДНК (приблизительно 820 п.о.), включающего последовательность оснований, кодирующую большую часть полипептида-предшественника. Результирующий фрагмент ДНК связывают с химически синтезированным олигодезоксирибонук- леотидным фрагментом, имеющим следующую формулу
5 -CGATATGAGCA
З -ТАТАС
Связанный фрагмент ДНК называют фрагментом Рге-ФНО.
Отдельно фрагмент ДНК, содержащий часть .участка промотора сгр, вырезают из плазмиды р№720 расщеплением эндонуклеазой Eco RI и Нра I, и фрагмент ДНК связывают со следующим химически синтезированным адаптером: 5 -AACTAGTACGCAAGTTCACGT.AAAAAGGGT.AAT 3 -TTGATCATGGGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC
Результирующий фрагмент ДНК связывают с фрагментом Pre-ФНО и связан- , ный фрагмент ДНК сшивают с фрагментом ДНК (приблизительно 4,3 т„п„о,), имеющим ген устойчивости к ампициллину плазмиды pBR322.
Плазмиду рНТКРЗ конструируют по описанной методике, вводят вЕ,со11 НВ101, культивируют в течение ночи при 37°С в модифицированной среде М-9. Культуру (0,05 мл) высевают в 5 мл той же среды, культивируют при 37°С в течение 1 ч, прибавляют 3-бе- та-индолакриловую кислоту до концентрации 20 мкг/мл и культивирование продолжают в течение ночи Клетки собирают центрифугированием, обрабатывают по методике, описанной в примере 2 (1) и получают просветленный лизат.
Лизат имеет цитотоксическую активность, равную 1, ед„ (L-929)/ мл.
П р и м е р 5. Получение и очистка полипептида человеческого ФНО„
Клетки E.coli HB101/pHT 91, полученные в примере 2 (2), используют для,получения полипептида человечес- jcoro ФНО с Для этого культивируют их в течение ночи при 37°С в бульоне LB, содержащем тетрациклин в концентрации 12,5 мкг/мл, высевают в 10 объемов модифицированной среды М-9, использованной в примере 2 (2), и культивируют при 37°С в течение 1 ч« После прибавления 3-бета-индолакриловой кислоты до концентрации 20 мкг/мл культивирование продолжают в течение 4 ч. Клетки собирают, обрабатывают и получают просветленный лизат. Лизат используют для очистки полипептида человеческого ФИО
В колонку ( см), набитую DEAE- Sepharose CL-6B (Pharmacia), предварительно уравновешенную 20 мМ буфером трис-HCl (рН 7,8), вводят 1030 мл ли- зата. Колонку промывают 3 л того же буфера, а затем элюируют линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3 М в том жег буфере со скоростью потока 133 мл/ч. Элюат фракционируют по фракциям 10 мл. Фракции, обладающие цитотоксической активностью, собирают и объединяют.
Выделение цитотоксической активности на этой стадии составляет 53%, а удельная активность повышается с приблизительно в 9 раз.
Соединенные активные фракции обессоливают и концентрируют до 1/10
объема ультрафильтрацией с использованием мембраны.
0 Концентрат подвергают препаративному изоэлектрофокусирующему гель- электрофорезу. Аликвоту концентрата наносят на пластинку ит полиакрил- амидного геля (0, см) с гра5 диентом рН от 5,6 до 6,1, созданным с помощью 1 тМ obiline (1KB) Электрофорез проводят при напряжении 2400 В в течение 16 ч при 15°С. Гель нарезают на куски шириной 10 мм и
0 , белок элюируют с помощью 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,8). Описанную операцию повторяют. Элюаты, имеющие цитотоксическую активность, объединяют и концентрируют с помощью ультрафильтрациио Концентрат наносят на колонку (0,7«25 см) с BiO-Gel Р-6(В10- RAD) и обессоливают. Результирующий обессоленньй образец является однородным с точки зрения электрофоре-
0 тического анализа в полиакриламид- ном геле с додецилсульфатом натрия и его используют в качестве очищенного полипептида человеческого ФИО для проведения анализа,
5 Примерб. Способ получения лиофилизованного полипептида человеческого ФНО.
Раствор очищенного полипептида человеческого ФНО, полученный по
0 примеру 5, используют для получения лиофилизованного полипептида человеческого ФНО.
10 мл раствора очищенного поли- е пептида человеческого ФНО, имеющего цитотоксическую активность 2, ед. (LM), смешивают с 0,1 объема 8% NaCl, содержащего 10% человеческого сывороточного альбумина и 20% D-ман- 0 нита. После доведения рН раствора до 6,8 раствор стерилизуют фильтрованием через мембрану (размер пор 0,2 мкм)о По 5 мл стерильного раствора помещают в стеклянные сосуды и лиофильно высушивают Каждый сосуд содержит по 10 ед. (LM) очищенного полипептида человеческого ФНО.
Пример (справочный). Получение к-ДНК кроличьего ФНОо
19
1, Получение и-РНК ФИО из кроличьих альвеолярных макрофагов
Кроликам (вес приблизительно 2,5 кг) внутривенно вводят мертвые сухие клетки Propionibacterium acnes в дозе 100 мг на кролика. Через 8 дней кроликов забивают. Легкие несколько раз промывают фосфатным солевым буфером через трубку, введенную в трахею животного, и собирают альвеолярные макрофаги. От 12 кроликов получают приблизительно 3x10 альвеолярных макрофагов.
Альвеолярные макрофаги суспендируют в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, и высевают в чашки Петри (диаметром 8 см) с плотностью клеток на чашку. Их предварительно культивируют при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода,, После предварительного культивирования, проведенного в течение 1 ч, эндотоксин (липополисахарид, полученный из E.coli), TPA (форбол-12-ми- ристат- 13-ацетат) и циклогексимид (ингибитор синтеза белка) прибавляют до концентрации соответственно 10 мкг/мл, Ю нг/мл и 1 мкг/мл. Культивирование продолжают еще в течение 4,0 - 4,5 ч (общее время культивирования 5,0 - 5,5 ч), культуральную среду удаляют отсасыванием, макрофаги, адгезированные к чашкам, лизи- руют и гомогенизируют в 5 М раствора гуанидилцианата, содержащем 0,6% N- лауроилсакрозината натрия и 6 мМ цитрата натрия. Гомогенизат выливают в 5,7 М раствор хлорида цезия, содержащий 0,1 М ЭДТА, и центрифугируют в течение 20 ч при 26500 об/мин с использованием ультрацентрифугио Осадо растворяют в небольшом количестве 7 раствора мочевины, содержащего 0,35 NaCl, 20 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 20 м ЭДТА, и выделяют осаждением этанолом От 12 кроликов получают 5,2 мг общей РНК
Фракцию общей РНК растворяют в 2 мл раствора ТЭ, использованного в примере 1 (1), и раствор нагревают при 65 С в течение 5 ыин. Добавляют раствор NaCl до результирующей концентрации 0,5 М, наносят на колонку с олиго(дТ)-целлюлозой, предварительно уравновешенной ТЭ-раствором, содержащим 0,5 М NaCl. Поли(А)-и-РНК эчюируют с колонки ТЭ-раствором с
10
20
выходом 314 мкг. 200 мкг результирующей поли(А)-и-РНК подвергают электрофорезу в 1%-ном агарозном геле в присутствии 6 М мочевины (рН 4) и фракционируют на 7 фракций в соответствии с молекулярными размерами Поли(А)-и-РНК выделяют из каждого фракционированного геля, расплавляя его при 70°С в течение 10 мин, с
30
последующей экстракцией фенолом и хлороформом и осаждением этанолом, Содержание и-РНК кроличьего ФИО в поли(А)-и-РНК, выделенной из каждой
., фракции, определяют и-РНК-трансля- ционным анализом с использованием ооцитов Xenopus laevis
Более высокую концентрацию и-РНК кроличьего ФИО выделяют из фракции,
20 соответствующей молекулярному размеру 1,6 - 2,7 т.п.о. (сокращенно называют обогащенной и-РНК кроличьего ФИО).
Фракцию, обогащенную и-РНК кроли25 чьего ФИО, полученную таким образом, используют в последующих экспериментах.
35 дТТФ, дЦТФ, ДТФ и дГТФ ХдСТФ метят
, удельная активность 4, распадов в минуту на 1 нмоль), 3 мкг олиго(дТ)2.,)8 , 80 ед обратной транскриптазы, полученной из вируса птичьего миелобластола, и инкубируют при 43°С в течение 50 мин. После этого реакцию останавливают прибавлением ЭДТАо Результирующий гибрид к-ДНК-и-РНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ (1:1) и выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Матрицу и-РНК удаляют обработкой щелочью при 65 - 70°С. Синтетическую к-ДНК вьщеляют осаждением этанолом
Осадок ДНК растворяют в 40 мкл 0,1 М буфера Нерез (рН 6,9), содержащего каждый из четырех дезоксири- бонуклеотидтрифосфатов дАТФ, дТТФ, дГТФ и дЦТФ в концентрации 0, 5 мМ, 70 мМ КС1, 5 мМ. MgCl2, 1,5 мМ 2-мер- каптоэтанол и 8 ед, E.coli ДНК-поли- меразы I (большой фрагмент), инкубируют при 15°С в течение 20 ч для
4S
50
55
синтеза к-ДНК. Реакцию останавливают прибавлением додецилсульфата натрия. к-ДНК экстрагируют смесью фенол/хло-. реформ и выделяют осаждением этанолом.
Результирующую к-ДНК растворяют в 100 мкл 50 мМ раствора ацетата натрия (рН 4,5), содержащего 1 мМ ZnSO, 200 мМ NaCl, 0,5% глицерина и 0,5 ед„ 1Q нуклеазы S1, и инкубируют при 37 С в течение 20 мин для расщепления структуры. Реакцию останавливают прибавлением ЭДТА. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ, ., а затем диэтиловым эфиром „ к-ДНК выделяют осаждением этанолом,
Полученную выше к-ДНК растворяют 20 в 100 мкл буфера 130 мМ какодилат натрия - 30 мМ трис-HCl (рН 6,8), содержащего 1 мМ CoClz, 0,1 мМ ди- тиотреитол, 0,2 мкг поли(А), 0,1 мМ Н-дЦТФ (удельная активность 5400 25 распадов в минуту на 1 пмоль) и 10 ед. концевой дезоксинуклеотидилтранс- еразы, инкубируют при 37°С в течение 20 мин для присоединения концов оли- го(дЦ) к 3 -концам к-ДНК„
Реакцию останавливают добавлением ЭДТА. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и диэтиловым эфиром. Олиго(дЦ)-концевую к-ДНК выеляют осаждением этанолом,, Олиго- (дЦ)-концевую к-ДНК растворяют в 35 10 мМ буфере трис-HCl (рН-7,4), соержащем 1 мМ ЭДТА и 100 мМ NaCl, таким образом, чтобы концентрация олиго(дЦ)-концевой к-ДНК была равна 0,2 мкг/мл.
. 4. Получение олиго(дГ)-концевой ДНК плазмиды pBR322.
pBR322 (10 мкг) растворяют в 100 мкл 20 мМ буфера трис-HCl (рН 7,4), содержащего 10 мМ , 50 мм (Ш. и мкг бычьего сывороточного альбумина, и прибавляют 15 ед0 эндонуклеазы Pst I. Смесь инкубируют при 37°€ в течение 1 ч, экстрагируют смесью фенол/хлороформ. ДНК выделяют из водной фазы осаждением этанолом, растворяют в 200 мкл того же буфера, который используют для присоединения к концам к-ДНК (за исключением того, что он содержит 80 ед. 55 концевой дезоксинуклеотидилтрансфе- разы Н-дГГФ вместо Н-дИТФ), и инкубируют пои 37 С в течение 20 мин для при30
45
SO
1Q ,
0 5
5 0
5
0
5
O
соединения к концу приблизительно 10 - 15 остатков дГ. Реакционную смесь экстрагируют смесью фенол/хлороформ и оли- го (ДГ)-концевую днк плазмиды pBR322 выделяют из водной фазы осаждением этанолом. Результирующую концевую плазмидную ДИК растворяют в том же буфере, который использовался для растворения олиго(дЦ)-концевой к-ДНК таким образом, чтобы концентрация концевой плазмидной ДНК была равна 2 мкг/мл.
50 мкл раствора олиго(дЦ)-концевой к-ДНК смешивают с 50 мкл раствора олиго(дГ)-концевой ДНК pBR322 и смесь последовательно инкубируют при в течение 10 мин, при 57°С в те65°С
чение 120 мин, при 45°С в течение 60 мин, при 35°С в течение 60 мин и при комнатной температуре в течение 60 мин для достижения связывания.
Штамм E.coli X 1776 трансформируют полученной выше рекомбинантной плаз- мид-ой. Для этого E.coli k 1776 культивируют при 37°С в 20 мл бульона L, содержащего 100 мкг/мл диаминопимели-- новой кислоты и 40 мкг/мл тимидина, до тех пор, пока мутность, измеряемая при 600 нм, не достигнет 0,5. Клетки собирают центрифугированием при 0°С и промывают 10 мМ буфером трис-HCl (рН 7,3), содержащим 50 мМ CaCl. Клетки снова суспендируют в 2 мл того же буфера и инкубируют при
0С в течение 5 мин. К 0,2 мл сус- пензии прибавляют 0,1 мл полученного выше раствора рекомбинантной плазмиды, оставляют стоять при 0°С на 15 мин и затем выдерживают в течение 2 мин при 42 С После этого прибавляют 0,5 мл использованного выше бульона LB с добавками и культивируют в течение
1ч. Отбирают аликвоту культуры, на- . носят ее на пластинку агара с содержащим добавки бульоном LB, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина, и культивируют при 37°С в течение приблизительно 12ч. Отбирают трансформированные организмы, устойчивые к тетрациклину, которые используют в качестве набора к-ДНК.
плазмиду, содержащую к-ДНК, кодирующую кроличий ФНО о Пробы 2 Р-меченой к-ДНК синтезируют по методике, описанной в разделе 2 с использованием и-РНК, полученной из индуктивных альвеолярных макрофагов по методике, описанной в разделе 1, за исключением тоги, что используют 2Р-дЦТФ с высокой удельной радиоактивностью. Отбирают колонии трансформированных организмов. Из 20000 колоний выбирают 50„
Затем 20 из выбранных 50 колоний подвергают .гибридизационно рет- рансляционному анализу. Ппазмидную ДНК экстрагируют из каждого трансформированного организма и фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах после термической денатурациио К фильтру прибавляют полученную в разделе 1 фракцию поли(А), содержащую кроличий ФИО, и инкубируют при 50°С в течение 3 ч для достижения гидриди- зации Прогибридизовавшуюся и-РНК выделяют и вводят в ооциты для определения того, представляет ли собой выделенная РНК и-РНК кроличьего ФНО. В результате этого обнаруживают три колонии, имеющие плазмиды, содержащие к-ДНК, сильно гибридизуемую с.и- РНК кроличьего ФНО. Фрагменты к-ДНК получают из плазмиды, содержащей к-ДНК наибольшего размера (около 750 п,о.), расщеплением с помощью рест- рикционной эндонуклеазы Dde I и используют в качестве пробы для дальнейшего отбора Эти фрагменты ДНК метят 32Р. Отбирают колонии трансформированных организмов, имеющих плазмиды, содержащие к-ДНК, сильно гибридизуемую мечеными пробами В этом испытании положительный результат дают 98 из 60000 колоний. Выделяют ре комбинантную плазмидную ДНК и к-ДНК вырезают расщеплением эндонуклеазой Pst Io Из размеры определяют электрофорезом в п олиакриламидном геле Отбирают 17 колоний трансформированных организмов, содержащих вставки к-ДНК размером не менее 1 Из трансформированного организма, содержащего к-ДНК наибольшего размера (трансформированный организм № X 1776/ /pRTNF 802; плазмида № pRTNF 802), выделяют клонированную к-ДНК и определяют ее последовательность оснований о
0
5
0
Трансформированный организм X 1776/pRTNF 802 культивируют в бульоне LB, содержащем диаминопимели- новую кислоту и тимидин. Клетки обрабатывают ДНК, расщепляют эндонуклеазой Pst I, очищают и получают клонированную к-ДНКо Фрагмент клонированной к-ДНК расщепляют-затем различными эндонуклеазами и определяют последовательности оснований фрагментов,
Последовательность оснований с 277-го по 738-е основание является участком, кодирующим полный кроличий ФНО. Основания с 34-го по 276-е являются последовательностью оснований, кодирующих полипептид, необходимый для образования предшественника кроличьего ФНО.
ПримерЗ (справочный)„ Выделение и очистка кроличьего ФИО
Кроликам (вес тела 2,5 - 3,0 кг) внутривенной инъекцией вводят по 50 мг умерщвленных сухих клеток Pro5 pionibacterium acnes. Спустя 8 дней кроликам внутривенной инъекцией вводят по 100 мкг эндотоксина. Через 2 ч у каждого кролгка забирают кровь сердечной пункцией. Кровь смешивают со 100 ед. гепарина натрия на 100 мл, клетки крови и нерастворимые соединения удаляюто От 400 кроликов получают 24 л плазмы.
К 24 л плазмы прибавляют ЭДТА (24 г) и 240 г цеолита, смесь пере5 мешивают в течение 1 ч, фильтруют через три фильтра с размерами пор 3, 1 и 0,2 мкм.
К 24 л фильтрата прибавляют 12 л 0,04 М буфера трис-HCl (рН 7,8), на0 носят на колонку ( см) с DEAE- Sepharose, уравновешенную 0,04 М буфером трис-HCl (рН 7,8), содержащим 0,1 М NaCl, После этого колонку промывают 75 л буфера трис-HCl 8рН 7,8),,
5 7,8), содержащего 0,1 М NaCl, и затем 50 л 0,04 М буфера трис-HCl (рН 7,8), содержащего 0,15 М NaCl, после чего элюируют 0,04 М буфером трис-HCl (рН 7,2), содержащим 0,18 М NaCb
0 -Элюат фракционируют на фракции по 8 л и собирают фракции, обладающие цито- токсической активностью. Активные фракции объединяют и разбавляют равным объемом 0,04 М буфера тр ис-НС1
5 (рН 7,8)4 Разбавленный раствор наносят на колонку ( см) с DEAE-Sep- harose. Колонку промывают 1 л 0,04 М буфера трис-HCl (рН 7,8) содержащего 0,1 М Nad, элюируют 5 л 0, буфера трис-HCl (рН 7,2), содержащег О,Ш М NaCl, фракционируют на фракци по 250 мл и фракции, обладающие цито токсической активностью, собирают и объединяют.
Активную фракцию нагревают при 60°С в течение 30 мин и быстро охлаждают до 4° С. Холодный раствор концентрируют ультрафильтрацией„
Результирующий концентрат наносят на колонку (5x80 см) с Sephaeryes-20 уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,1 М NaCl, и элюируют тем же буфером, Элюат фракционируют на фракции по 40 мл и активные фракции собирают, объединяют и концентрируют ультрафильтрацией .
Концентрат наносят на колонку с Zn -хедатной сефарозой. Колонку (1, см) наполняют хелатной сефарозой (смола с фиксированной имино- диуксусной кислотой), промывают 120 мл раствора хлорида цинку (1 мг/ /мл) и уравновешивают 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим О,I M NaCl. После этого в колонку вводят концентрат, полученный на предыдущей стадии, элюируют тем же буфером Собирают фракции, не адсорбирующиеся на колонке о Цитотоксичес- кая активность почти полностью выделяется в этих фракцияхо
Активные фракции, полученные на предыдущей стадии, концентрируют и наносят на колонку (1,5x90 см), уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М NaCl, . элюируют тем же буфером и собирают активные фракции. Этот образец представляет собой очищенный кроличий плазменный ФИО
Полученный таким образом очищенный кроличий плазменный ФИО используют в примерах 3 и 4.
П р и М е р 9 (справочный). Определение N-концевой и С-концевой аминокислотных последовательностей кроличьего плазменного ФНО„
Очищенный кроличий плазменный ФИО, полученный в примере 2, используют для определения N-концевой и С-концевой аминокислотных последовательностей. N-концевую аминокислотную последовательность определяют разложением по способу Эдмана. Результирующие фенилтиогидантоинамино5
кислоты идентифицируют жидкостной хроматографией высокого давления.
С-концевую аминокислотную после- е довательность определяют ферментативным способом с использованием карбоксипептидаз„ Очищенный кроличий плазменный ФИО расщепляют карбоксипептидаз ами А и Y при молярном соотQ ношении фермента и субстрата, равном соответственно 1:25 и 1:1000. Свободные аминокислоты, выделяющиеся из С-окончания кроличьего плазменного ФИО в результате двойного отщепления,
5 идентифицируют с помощью аминокислотного микроанализатора.
Установлено, что N-концевые и С- концевые аминокислотные последовав тельности кроличьего плазменного ФИО
0 являются следующими:
N-окончание - Ser-Ala-Ser-Arg-Ala о о
С-окончание - . , „ „Val-Tyr-Phe-Gl y-TIe-TIe- Ala-Leu.
Пример 10 (справочньй). Получение антитела против кроличьего плазменного ФИО.
Раствор ФИО, содержащий 1, едо (L-929) очищенного кроличьего плазменного ФИО, полученного в приг- мере 2, эмульгируют с равным объемом полного стимулятора Фрейнда и эмульсию вводят подкожной инъекцией в спину морских свинок в нескольких местах Животных иммунизуют таким же 5 способом через 1,3 и 6 нед. Кроме того, через 6 нед такое же количество очищенного кроличьего плазменного ФИО вводят внутрибрюшинной инъекцией вместе с гелем гидроокиси алюминия. Цельную кровь отбирают сердечной пункцией через 9 нед после первой иммунизации, центрифугируют и получают антисыворотку, содержащую антитела против кроличьего плазменного ФИО,
Антисыворотку пропускают через колонку, снабженную сывороточными белковыми компонентами нормальных кроликов. Проводя операцию три раза, получают очищенные антитела, специфические по отношению к кроличьему плазменному ФИО о Иммуноэлектрофорез и методики двойной диффузии через гель подтверждают, что это антитело образует одну полосу осадка с очищен- 5 ным кроличьим плазменным ФИО.
Этот раствор антитела, разбавленный приблизительно в 60000 раз, обладает способностью нейтрализовать 50%
0
0
5
0
27173985528
от 500 ед. (L-929) цитотоксической Формула изобретения активности кроличьего плазменного
ФИО, а разбавленный в 1000 раз может Способ получения полипептида, об- полностью нейтрализовать 50 ед„ (LM) падающего активностью фактора некро- цитотоксической активности кроличье- . 5 за опухоли человека, характеризую- го плазменного ФНО„щегося формулой А или В, или
Мег-х-В В, где А представляет собой:
I
Thr Pro Ser Asp Lys Pro ValAla His Val
Val Ala Asn Pro Gin Ala GluGly Gin Leu
Gin Trp Leu Asn Arg Arg AlaAsn Ala Leu
Leu Ala Asn Gly Val Glu LeuArg Asp Asn
Gin Leu Val Val Pro Ser GluGly Leu Tyr
Leu He Tyr Ser Gin Val LeuPhe Lys Gly
ч
Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr lie Ser Arg lie Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala He Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro He Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu
Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu He Asn Arg Pro Asp Tyr .Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly He He Ala
Lcu. „ fcaЈP
7 $- Scr-Scr-Scr-Arg« «te J
)fcscr Thr Glu Ser Met He Arg Asp Val Glu ,
Leu Ala Glu Glu Ala Lou Pro Lys Lys Thr
Gly Gly Pro Gin Gly Ser Arg Arg Cys. Leu Phe Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu He Val. Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe Cys Leu Leu . His Phe Gly Val He Gly Pro Gin Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Sec Leu He Ser Pro Leu Ala Gin Ala Val Arg ... tic,
заключающийся в том, что культивируют штамм бактерий Escherichia coli 1М103/рНТТ26 .или EoColi HB101/pHTR91 или Е„соН HB101/pHTS11 5 или E,coli HB101/pHTS37 или E.coli HB101/pHTRP3 или E.coli HBl01/pHTRD4 в LB бульоне, модифицированной М-9 среде или TG среде при 37°С, получают клеточный лизат, центрифугируют его, очищают путем нанесения лизата на колонку с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенную трис-HCl буфером с рН 7,8 с после
дующей элюцией линейным градиентом NaCl от 0 до 0,3 М, обессоливанием
.активных фракций, Концентрированием ультрафильтрацией, иэоэлектрофокуси- рующим гель-электрофорезом в буфере с градиентом рН 5,6 - 6,1, элюирова- нием полипептида с помощью трис-HCl при рН 7,8, объединением элюатов и концентрированием с помощью ультра, фильтрации и гель-фильтрации на колонке с Био-гелем0
