Штамм ЕNтеRоVIRUS SUIS для диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней Советский патент 1987 года по МПК C12N7/00 A61K39/225 

10

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтерови- русов свиней, используемый для диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней.

Цель изобретения - штамм энтеро- вируса свиней, обладающий реп родук- тивной активностью в культуре клеток почки поросенка, безвредный и ареакто : генный для лабораторных животных,

Штамм депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов МСХ СССР под № 287/5, назван К-9 Enterovirus suis- -jg XI и имеет следующие признаки.

Морфология, Сферическая форма, типичная для энтеровирусов, имеет ико- саэдральную симметрию, размер вириона 26-28 нм,

.Антигенная структура, В реакции перекрестной нейтрализации штамм серологически отличается от референтных штаммов известных серотипов энтеровирусов свиней,

Биологические свойства. Штамм К-9 Enterovirus suis-XI обладает,репродуктивной активностью в культуре пер- вичнотрипсинизированных клеток почек эмбриона свиньи и перевиваемых клеток линии СПЭВ и накапливается в них

20

25

30

до ТЦДср,/мл в течение 48 ч при 37 + 0,5°С, Обладает бляшкообразуюишми свойствами на первично-трипси- низированных клетках почек эмбриона свиньи и перевиваемых клетках линии, СПЭВ,, Образует однородные бляшки размером -1,5 мм.

Физико-химические свойства. Является РНК-содержащим, репродукция вируса в культуре клеток не подавляется присутствием в поддерживающей среде 100 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиурИ ина и 0,1-1,0 мкг/мл актиномицина Д, устойчив к воздействию хлороформа, эфира и трипсина, а также сред со начениями рН 2,0-11,0. Понижает титы на 2-31g после прогревания

ри 50°С в течение 60 миН в присутствии 1 М MgClj,

. 11ммуногенность, Вызывает серокон- у кроликов; в гипериммунных роличьих сыворотках вируснейтрали- антитела образуются в титре 1:256-1:512,

Безвредность, Не вызывает отклоений от физиологической нормы у нтравенозно и инт амускулярно иноку- ированных кроликов.

40

45

35

gQ

55

752

Пример 1, Использование штамма К-9 энтеровируса свиней в качестве антигена для обнаружения и идентификации антител в сыворотках крови . больных и переболевших животных.

Обнаружение и идентификацию антител проводят В реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток. Для постановки РН готовят двукратные разведения сывороток в объеме 0,5 мл и к каждому разведению сыворотки добавляют по О,5 мл антигена с содерg

0

5

0

0

5

жанием вируса в 0,1 мл 100 ТЦДг,,, Ви5

УО рус-сывороточную смесь вьщерживают

один час.в термостате при 37°С, после чего смесь каждого разведения по 0,2 мл вносят в 2-4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростовая среда заменена на 0,8 мл поддерживающей. Учет результатов титрования антител проводят на 4 и 7 сут. Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки, которое нейтрализует 100 вируса в-50% инокулированных вирус- сывороточной смесью в пробирках,

Результат считается положительным при нарастании титра антител, в парных сыворотках в четыре и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более пpo

центах сывороток крови однократно. обследованных животных, .

Пример 2, Обнаружение анти-х гена (вируса)в мазках-отпечатках из патологического, материала методом прямой иммунофпуоресценции (ИФ), Дпя исследования методом иммунофпуоресценции на обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки из свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в aцeтoнej наносят на них флуоресцирующий .иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фосфатно-буфер- I

ным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты иссле- Q дуют люминесцентным микроскопом. Положительным результатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне мозговой ткани, которая светится серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификация выделенного вируса в культуре клеток.

Типирование вируса проводят в реакции нейтрализации на культуре кле5

ток с помощью иммунной сыворотки к вирусу штамма К-9, входящего в состав набора диагностикумов. Иммунная сыворотка используется в дозе 20 нейтрализующих доз. Вирус для типирова- ния используют в дозе 1000 ТЦЦ . Для типирования 0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦД смешивают с 0,5 мл иммунной СЫВОР.ОТКИ с

содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрализующих доз. После выдерживания вирус- ,сывороточной смеси в течение 1,5 ч при 37°С по 0,2 мл ее вносят в четыре пробирки с культурой клеток, ростовая среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддерживающей и ставят в термостат на инкубацию при 37 С, Учет результатов проводят на 4 и 7 сут,

Результат типирования считают по- ложительньм, если в 50% инокулирован- ных вирус-сывороточной смесью пробирок сыворотка нейтрализовала вирус (ЦПД не отмечено),

10

283754

Пример 4, Идентификация вируса в культуре клеток методом имму- нофлуоресценции,

Выращенную на покровных стеклах культуру клеток заражают выделенным вирусом и инкубируют в термостате до появления ЦПД, После наступления ЦПД стекла извлекают, промывают фосфат- но-буферным раствором, подсушивают.и фиксируют ацетоном. Затем на препараты наносят фулоресцируюш ий иммуноглобулин к штамму К-9, выдерживают |30 мин при 37°С, обильно промывают

g фосфатно-буферным раствором ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают. Микроскопию проводят на люминесцентном микроскопе.

Положительным результатом считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток в виде фокусов из 3-4 пораженных клетокi :Формула изобретения ; Штамм Enterovirus suis 287/5

25 () диагностики энтеровирус- ного гастроэнтерита свиней.

20

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтеро- вирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней. Целью изобретения является штамм энтеровируса свиней, обладающий репродуктивной активностью, в культуре клеток почки поросенка, безвредный и ареактогенный для лабораторных животных. Штамм К-9 Enterovi- rus suis XI вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела образуются в титре 1:256-. 1:512. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интраве- нозно и интрамускулярно инокулирован- ных кроликов. О S (Л со N5 00 00 vj ел