Штамм ЕNтеRоVIRUS SUIS для диагностики энтеровирусного гастроэнерита свиней Советский патент 1987 года по МПК C12N7/00 A61K39/225 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет,, собой штамм нового серотипа энтеровирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусного гастроэнтерита свиней.

Цель изобретения - штамм энтеро- вируса свиней, обладаюпщй повьшенной репродуктивной активностью в культуре клеток почки поросенка, безвредный и ареактогенный дпя лабораторных животных (кроликов).

Штамм депонирован в коллекции ВГНКИ ветпрепаратов МСХ СССР под 9 288/5, назван К-22 Enterovirus su- Is-XII и имеет следующие признаки.

Морфология. Сферическая форма, типичная для энтеровирусов свиней, имеет икосаэдральную симметрию, размер вириона 26-28 нм.

Антигенная структура. В реакции перекрестной нейтрализации штамм серологически отличается от референтных штаммов известных серотипов энтеровирусов свиней.

Биологические свойства. Штамм К-22 Enterovirus suis-XII обладает репродуктивной активностью на культуре первично-трипсинизированных клеток почек эмбриона свиньи и перевиваемых клеток линии СПЭВ и нака1П- ливается в них до 10 ТЦД /мл в течение 24 ч при 3710,. Обладает бляшкорбразующими свойствами на первично-трипсинизированных клетках почек эмбриона свиньи и перевиваемых клетках линии СПЭВ. Образует однородные бляшки размером 0,5-1,0 мм.

Физико-химические свойства. Является РНК-содержащим, репродукция вируса в культуре клеток не подавляется присутствием в поддерживающей среде 100 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиуриди- на и 0,1-1,0 мкг/мл актиномицина Д, устойчив к воздействию хлороформа, эфира и трипсина. Не ингибируется средами со значениями рН 2,0-11,0. Понижает титры на 1,5-2,5 Ig ТЦД после прогревания при 50°С в течение 30-60 мин. Термоустойчив при прогре- в-ании при в течение 60 мин в присутствии 1 М MgClj.

Иммуногенность. Вызывает серокон- версию у кроликов; в гипериммунных кроличьих сыворотках вирусней- рализующие антитела обнаруживают в титре 1: 28-1:512. .

Безвредность. Не вызьгеает отклонений от физиологической нормы у инт

5

равенозно и интрамускулярио инокули- рованных кроликов.

Пример 1. Использование штамма К-22 энтеровируса свиней в качестве антигена для обнаружения и идентификации антител в сыворотках крови больных и переболевших животных.

Обнаружение и идентификацмо антител проводят в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток. Для постановки РН готовят двукратные разведения сывороток в объеме 0,5 мл и к каждому разведению сыворотки добавляют по 0,5 мл антигеиа с содержанием вируса в 0,1 мл 100 ТЦД. Вирус-сывороточную смесь выдерживают 1 ч в термостате при 37°С, после чего смесь каждого разведения по 0,2 мл вносят в 2-4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростовая среда заменена на 0,8 мл поддерживающей. Учет результатов титрования антител проводят на 4 ,и 7 сут. Титром антител считают наибольшее, разведение сыворотки, которое нейтрализует 100 ТЦДур вируса в 50% инокулированныз вирус-сывороточной смесью пробирках.

Результат считается положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках в четыре и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более про- 5 центах сывороток крови однократно обследованных животных.

0

5

0

0

5

Пример 2. Обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках из патологического материала методом прямой иммунофлуоресценции (ИФ). Дпя исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки из свежего или свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, наносят на них флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты исследуют люминесцентным микроскопом. Положительным результа- 5 том исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне мозговой ткани, которая светится серовато-зеленоватым цветом.

0

Пример 3. Идентификация выделенного вируса в культуре клеток,

Типирование вируса проводят в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сыворотки к вирусу штамм К-22, входящего в состав набора диагностикумов. Иммунная сыворотка используется в дозе 20 нейтрализующих доз. Вирус Для типирова- ния используют в дозе 1000 ТЦД. Для типирования 0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦЦуд смешиваю с 0,5 мл иммунной сыворотки с содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрализующих доз. После выдерживания вирус-сывороточной смеси в течение 1,5 ч при по 0,2 мл ее вносят в четыре пробирки с культурой клеток, ростовая среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддерживающей и . ставят в термостат на инкубацию при 37 С, Учет результатов проводят на 4 и 7 сут.

Результат типирования считают положительным, если в 50% инокулиро- ванных вирус-сывороточной смесью пробирок сыворотка нейтрализовала вирус (ЦПД не отмечено).

Составитель Г. Марченко Редактор С. Патрушева Техред А.Кравчук Корректор Л.Патай

Заказ 3453/29 Тираж 499 - Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 4. Идентификация вируса в культуре клеток методом им- мунофлуоресценции,

Выращенную на покровных стеклах культуру клеток заражают выделенным вирусом и инкубируют в термостате до появления ЦПД. После наступления ЦДЦ стекла извлекают, промывают фос- фатно-буферным раствором, подсушива- ;ют и фиксируют ацетоном. Затем на препараты наносят флуоресцирующий иммуноглобулин к штамму К-22, выдерживают 30 мин при 37 С, обильно про- мывают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают. Ь кроскопию проводят на люминесцентном микроскопе.

Положительным результатом считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток в виде фокусов из 3-4 пораженных клеток.

Формула изобретения

Штамм Enterovirus suis 288/5 (ВГНКИ) для диагностики энтеровирус- ного гастроэнтерита.свиней.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтеро- вирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусного гастроэн- ,терита свиней. Целью изобретения яв- ляется штамм энтеровируса свиней, обладающий повышенной репродуктив- ной активностью в культуре клеток почки поросенка, безвредный и ареак- тогенный для лабораторных животных, Штамм K-22Enterovirus suis-Xl I вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела обнаруживают в титре 1:128-1:512. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интравенозно и интрамус- кулярно инокулированных кроликов. i (Л САЭ tc 00 О9 4