Штамм ЕNтеRоVIRUSSUIS для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтеровирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней.

Цель изобретения - получение нового серотипа штамма энтеровируса свиней, обладаюдего репродуктивной активностью в культуре перевиваемых клеток линии СПЭВ, безвредного и аре- актогенного для лабораторных животных .

Штамм депонирован в ко ллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпре парятов; под № 8, назван авторами Ч-73 En.N-.rovirus siiis-15 и имеет следукяцие признаки.

Морфология. Сферическая форма, типичная для энтеровирусов свиней, имеет икосаэдральную симметрию, размер вириона 26-28 нм.

Антигенная структура. В реакции перекрестной нейтрализации штамм серологически отличается от референтных штаммов известных серотипов энтеровирусов свиней.

Биологические свойства. Итамм Ч-73 Enterovirus suis-15 обладает репродуктивной активностью на культуре перевиваемых клет.ок лшпш СПЭБ и

эс

:л

накапливается до TIUTg-fl/MA чение 48 ч при . Обладает бляшко- образуюп5ими свойствами на перевиваемых клетках линии СПЭВ. Образует однородные бляшки размером 1-1,5 мм.

Физико-химические свойства. Является РНК-содержащим, репродукция вируса в культуре клеток не подавляеткоторое нейтрализует 100 ТЩ j-o виру са в 50% инокулированных вируссьшо- роточной смесью пробирках, f Результат считают положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках в четьфе и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более процентах

. ся присутствием в поддерживающей ере- сывороток крови переболевших живот20

25

де 100 мкг/мл 5-бром-2-дезоксиури- дина на 0,1-1,0 мкг/мл актиномици- на Д, устойчив к воздействию хлороформа, эфира и трипсина, а также сред со значением рН 2,0-11,0. Понижает титры на 2-3 Ig ТВД50//ИА после прогревания при 50°С в течение 30-60 мин. Термоустойчив к прогреванию при в течение 60 мин в присутствии 1 М MgCl,.

Нммуногенность. Вызывает серокон- версию у кроликов; в гипериммунных кроличьих сьгооротках вируснейтрали- зующие антитела образуются в титре 1:1024г.

Безвредность. Не вызывает отклонений от физиологической нормы у ин- травенозно и интрамускулярно инокулированных кроликов.

Диагностику энтеровирусной пневмо- о НИИ свиней проводят путем вьщеления к идентификации вьщеленных изоля- тов вирусов в реакции нейтрализации на культуре клеток СПЭВ, а также выявлением и идентификацией сывороточных антител у больных и переболевших животных.

П р и м е .р 1. Использование штамма Ч-73 энтеровируса свиней в качестве антигена для обнаружения и идентификации антител в сьторот- ках крови больных и переболевших животных.

Обнаружение и идентификацию антител проводят в реакции нейтрализации (рН) на культуре клеток. Дпя постановки рН готовят двукратные разведения сьгоороток в объеме 0,5 мл антигена с содержанием вируса а 0,1 мл 100 ТЦЦ-.. Вирус-сьшороточную смесь вьщерживают 1 ч в термостате при 37 С после чего смесь каждого разведения по 0,2 мл вносят в 2-4 пробирки с монослоем культуры клеток, в которых предварительно ростовая среда.заменена на 0,8 мл поддерживающей. Учет результатов титрования антител проводят на 4-7 сут. Титром антител считают наибольшее разведение сыворотки.

ных.

Пример 2. Обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках на патологическом материале методом пря 5 мой иммунофлуоресценции .(11Ф) .

Для исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных пред- .метных стеклах готовят мазки-отпечат ки из свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, наносят на них флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фос- фатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты исследзтот под люминесцент ным микроскопом. Положительным ре- зультатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение ци топлазмы клеток на фоне ткани, кото рая светится серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификация вы деленного вируса в культуре клеток.

I

Типирование вируса проводят в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сьшоротки к вирусу штамма Ч-73, входящего в состав набора диагностикумов. Дпя титрования 0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦЦ50 смешивают с 0,5 мл иммунной сьшоротки с дс содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрали зующих доз. После выдерживания ви- рус-сьшороточной смеси в течение 1,5 ч при по 0,2 мл ее вносят четыре пробирки с культурой клеток, ростовая среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддержив ющей и ставят в термостат на инкуба цию при 37°С. Учет результатов пров дят на 4 и 7 сутки.

Результат типирования считают по ложительным, если в 50% инокулированных вируссьшороточной смесью про бирок сыворотка нейтрализовала виру (1ЩД не отмечено) .

40

50

55

которое нейтрализует 100 ТЩ j-o вируса в 50% инокулированных вируссьшо- роточной смесью пробирках, f Результат считают положительным при нарастании титра антител в парных сыворотках в четьфе и более раз или при обнаружении титров антител 1:32 и выше в 50 и более процентах

0

25

о

ных.

Пример 2. Обнаружение антигена (вируса) в мазках-отпечатках на патологическом материале методом пря- 5 мой иммунофлуоресценции .(11Ф) .

Для исследования методом иммунофлуоресценции на обезжиренных пред- .метных стеклах готовят мазки-отпечатки из свежезамороженного материала. Препараты высушивают, фиксируют в ацетоне, наносят на них флуоресцирующий иммуноглобулин, помещают во влажную камеру, затем промывают фос- фатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Приготовленные препараты исследзтот под люминесцентным микроскопом. Положительным ре- i зультатом исследования считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток на фоне ткани, которая светится серовато-зеленоватым цветом.

Пример 3. Идентификация выделенного вируса в культуре клеток.

I

Типирование вируса проводят в реакции нейтрализации на культуре клеток с помощью иммунной сьшоротки к вирусу штамма Ч-73, входящего в состав набора диагностикумов. Дпя титрования 0,5 мл вируса с содержанием его в 0,1 мл 1000 ТЦЦ50 смешивают с 0,5 мл иммунной сьшоротки с дс содержанием в 0,1 мл ее 20 нейтрализующих доз. После выдерживания ви- рус-сьшороточной смеси в течение 1,5 ч при по 0,2 мл ее вносят в четыре пробирки с культурой клеток, ростовая среда в которых предварительно заменена на 0,8 мл поддерживающей и ставят в термостат на инкубацию при 37°С. Учет результатов проводят на 4 и 7 сутки.

Результат типирования считают положительным, если в 50% инокулированных вируссьшороточной смесью пробирок сыворотка нейтрализовала вирус (1ЩД не отмечено) .

40

50

55

1

Пример 4. Идентификация вируса в культуре клеток методом имму- нофлуоресценции.

Выращенную на покровных стеклах культуру клеток заражают выделенным вирусом и инкубируют в термостате до появления ЦПД. После наступления.ЦПД стекла извлекают, промьшают фосфатно буферным раствором, подсушивают и фиксируют ацетоном. Затем на препараты наносят флуоресцирующий иммуногло булин к штамму Ч-73, выдерживают 30 мин при 37 С, обильно промьшают фосфатно-буферным раствором, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают. Микроскопию проводят на люминесцентном микроск опе.

Положительным результатом считают специфическое ярко-зеленое свечение цитоплазмы клеток в виде фокусов на 3-4 пораженных клеток. I Пример 5. Опыт по определению типовой принадлежности выделенного от свиней штамма энтеровируса Ч-73 в перекрестной реакции нейтрализации в культуре клеток СПЭВ с эталонными и выделенными (Г-95, ;Б-111) штаммами энтеровирусов свиней

Результаты типирования штамма приведены в таблице.

Данные типирования выделенного штамма энтерови руса свиней Ч-73 с эталонными и выделенными штаммами и изучения антигенного родства между ними доказывают принадлежность его к неизвестному серотипу.

Пример 6. Для выделения вирусов от больных свиней отбирают на

10

485

t5

20

25

30

5

16

зальные смьшы, пробы легких, бронхиальных лимфатических узлов, а-для выявления антител - сьюоротки крови от больных и переболевших животных.

Для выявления и идентификации сывороточных антител в реакции нейтрализации на культуре клеток используют штаммы известных (Konratice-1; Т80, F59-2; F34-3; F78-4; F12-5; F7-6; У13-8| К-9-11; К-22-12; Л-90-13; М116-14) и нового (Ч-73-15) серотипов энтеровирусов свиней.

Для типирования выделенных изоля- тов вирусов используют гипер1-1ммун- ные кроличьи сыворотки к указанным выше штаммам.

Из 70 проб органов и назальных . смьшов, отобранных в очагах заболевания свиней энтеровирусной пневмонией, выделяют 14 изолятов вирусов, из которых 2 идентичны штамму Ч-73 нового серотипа 15 энтеровирусов свиней.

Из 39 исследованных сывороток крови в 14 выявляют вируснейтрализую- щие антитела в диагностических титрах к штамму антеровируса свиней нового серотипа 15.

Полученные результаты дают возможность поставить диагноз заболевания свиней энтеровирусной пневмонией и разработать мероприятия,по ее профилактике .

Формула изобретения

Штамм Enterovirus suis ВГНКИ № 8 для диагностики энтеровирусной пневмо- НИ1-1 свиней.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм нового серотипа энтеровирусов свиней, используемый для диагностики энтеровирусной пневмонии свиней. Целью изобретения является получение штамма нового серотипа энтеровирусной пневмонии свиней, обладающего репродуктивной активностью в культуре перевиваемых клеток СПЭВ, безвредного и ареактогенного для лабораторных животных. Штамм Ч-73 ENTEROVIRUS SUIS - 15 депонирован в коллекции ВГНКИ код N8, вызывает сероконверсию у кроликов, в гипериммунных кроличьих сыворотках вируснейтрализующие антитела образуются в титре 1:1024. Штамм не вызывает отклонений от физиологической нормы у интравенозно и интрамускулярно инокулированных кроликов. 1 табл.