Способ количественного определения компонентов фламина Советский патент 1987 года по МПК G01N33/15 

1133

РТзобретение относится к медицинеj в частности к способам количественного определения компонентов (щамина, являющегося смесью гликозидов и агли- конов флавоноидной природы и применя емого в качеств е желчегоннох о средст- ва при заболеваниях печени и желчного пузыря.

Цель изобретения - повьшение точ- ности определения.

Поставленная цель достигается тем, что в анализируемый раствор фламина вводят внутренний стандарт - раствор салициловой кислоты и смесь подвер- гают хроматографическому разделению последовательно в системах вода - ацетонитрил - уксусная кислота - Te.f™ рагидрофуран (71,5;2055:355) и вода - ацетонитрил - уксусная кислота (12; s7:1).

Способ осуществляют следующим об- .разом.

Смешивают равные объемь анализируемого раствора фламина в системе 1 вода - ацетонитрил - уксусная кис- дота - тетрагидрофуран 7155:20;5;3j5 JH раствора салициловой кислоты опре™ деленной концентрации в той же системе. Пробу полученной смеси вводят ;В колонку жидкостного хроматографаз наполненную силикагелем размером мкм с поверхностно- привитьгми углеводородными радикалами Cg-C,g, Элюентом для хроматографического раз- деления содержащихся во фламине гликозидов служит система I агликонов - система IT вода - ацетонитрил уксусная кислота (12|7П), Для детектирования применяют ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны, используемый в интервале 290-320 нм„ Из полученных хроматограмм определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннего стандарта кото- рое не зависит от величины введенной пробы и скорости потока элюента,Процентное содержание отдельных компонентов фламина рассчитывают по формуле

V - (.C- Ь)-100

.. ,

(1)

де S,, SB,C

К

площадь пика компонента; площадь пика внутреннего стандарта;

коэффициенты пропорциональности, определенные по ка либровочным графикам компонентов;

2

0

5 0

5 0 g 0 5

0

5

а концентрация субстрата фламина Б анализируемом раство- ре (мкг/мл)I . b - отрезок3 отсекаемый калибровочной кривой на оси ординат.

Для определения коэффициентов пропорциональности отдельных компонентов фламина строят калибровочные графики зависимости С где §,/5д.- отношение плош;адей пиков каждого индивидуального компонента фламина на хроматограмме и салициловой кислоты; Cj - концентрация компонента в растворах серии с внутренним стандартом. Для построения графиков берут .точную навеску каждого индивидуального компонента фламина и готовят путем разбавления системой I серию из пяти растворов различной концентрации Внутренний стандарт готовят растворением О504 г салициловой кислоты очищенной возгонкой в 100 мл системы I в мерной колбе вместимостью 500 мл с последующим доведением до метки той же системой растворителей. Затем смешивают по 1 мл раствора определенной концентрации каждого индивидуального компонента фламииа и раствора внутреннего стандарта и проводят хроматографи- ческий анализ этой серии растворов в ступенчатом режиме; в системе I - 1-13 мин,, в системе II - 13-30 мин.

Обоснование параметров способа представлено в табл, 1,

Пример 1 о Количественное определение кемоферол-З-глюкозида во фламине„

Анализ кемпферол 3-глюкозида начинают с построения калибровочного графика,, Для этого 20 мг хроматогра- фически чистого кепмферол-3-глюкозида взвешивают на весах типа Sartorius и растворяют в 10 jcn системы I, Из полученного раствора путем разбавления системой I готовят растворы кемп- ферол- 3-глюкозида с концентрациями 20, 40V 60, 80 и 100 мкг/мл. К 1 мл каждого из растворов добавляют по 1 мл Os008%-Horo раствора салициловой кислоты (внутренний стандарт). Полученные раст1воры поочередно вводят в колонку жидкостного хроматографа, и хроматографнческий анапиз раствора каждой концентрации повторяют пять раз, Для анализа нсао ьзуют жидкостный хроматограф фирм Spectra Physics , дозировочный кран с петлей объемом 10 мкл, хроматографическую колонку, наполненную адсорбентом Nucleosil RP-18 с размером частиц 10 мкм, детектор SP-8400 при длине волны 315 нм. Скорость потока элюен- та - системы вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран (71,5:20:5:3,5) 1 мл/мин. Площади пи ков кемпферол-3- глюкозида и салициловой кислоты на хроматограмме измеряют с помощью интегратора SP-4100. Строят калибровочный график, отклады вая 8 /8ррПротив величин С. Коэффициент К, определённый по калибровочной кривой, равен 0,053+0,004; b равно-0,107.. Исследуемый образец фла мина (20 мг) серии 26084, растворяют в 10 мл системы I. К 1 мл этого раствора добавляют 1 мл 0,008%-ного ра створа салициловой кислоты, пробу полученной смеси вводят в колонку хроматографа и проводят пятикратный анализ в ступенчатом режиме: система I - 1-13 мин, система II - 13-30мин. Из хроматограмм находят площади пиков кемпферол-3-глюкозида и салициловой кислоты, рассчитывают их соотношение (S,./5„.) и по формуле (1) оп

ft О.С

ределяют процентное содержание кемп- ферол-3-глюкозида (табл, 2).

Содержание кемпферол-3-глюкозида в данном образце фламина 13,55+0,80%

Пример 2. Количественное определение изосалипурпозида во флами- не.

Анализ изосалипурпозида начинают с построения калибровочного графика. Для этого 20 мл (точная навеска) хро- матографически чистого -изосалипурпо- зида растворяют в 10 мл системы I. .Из полученного раствора путем разбавления системой 1 готовят растворы с концентрациями 40, 80, 120, 160, 200 мкг/мл. К 1 мл каждого из растворов добавляют по 1 мл 0,008%-ногЪ раствора салициловой кислоты (внутренний стандарт), т.е. исходньй раствор разбавляют в 2 раза. Полученные растворы изосалипурпозида с концентрацией 20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл поочередно вводят в колонку жидкостного хроматографа, и анализ раствора каждой концентрации повторяют 5 раз. Условия хроматографического анализа и оборудование аналогичны приведенным в примере 1. По данным хроматографического анализа, приведен

ным в табл. 3, строят калибровочный график, откладывая на оси кординат отношения площадей пиков изосалипурпозида и внутреннего стандарта

(.), а на оси абсцисс - концентрация изосалипурпозида (С). Коэффициент К, определяемый как тангенс угла наклона калибровочного графика,

равен 0,058; величина отрезка Ь, отсекаемого прямой на оси ординат, рав- .на 0,098.

Количественные значения коэффициентов К и Ь, характеризующие прямую

линиюр были рассчитаны также по методу наименьших квадратов по следующим формулам:

,п к - - (ZXj)(EY;) . 20 1 N2:X - (ГХ;)

(SY;) (ZX;) -(SX;) (SIX; Y; )

D - NrX. - (.) 1

2g где Xj - концентрация изосалипурпозида;

N - число опытов;

Y. - отношение площадей пиков

изосалипурпозида и салициловой кислоты при данной концентрации изосалипурпозида.

30

Используя данные табл. 4, вычислили К и Ь: К 0,058; Ь .0,098..

Используемый образец фламина (20 мг) растворяют в 20 мл системы I, К 1 мл этого раствора добавляют 1 мл 0,008%-ного раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку хроматографа и проводят пятикратный анализ в ступенчатом режиме: система I - до 13-й минуты, система II - с 13-й по 30-ю минуту при скорости потока 1 мл/мин. Из хроматограмм находят отношение площадей пиков изосалипурпозида и салициловой кислоты () и по общей формуле определяют процентное содержание изосалипурпозида во фламине.. Полученные

результаты приведены в табл. 5.

Содержание изосалипурпозида в данном образце фламина 8,63+0,24%.Точность способа-прототипа +3,5-6%.

При проведении опытов были использованы готовые колонки, упакованные сорбентом марки Nucleosil C,g (сили- кагель с привитыми октадецилсилано- выми группами) с размером частиц 10 .мкм.

Для изготовления хроматографичес ких систем использовали ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х.ч. ТУ-6-09-06-1092-82; тетрагидрофуран ч., ТУ 6-09-3686-77, который вьщер- живали над сухой щелочью и перегоняли при атмосферном давлении| уксус ную кислоту, X.4.S ГОСТ 61-75, которую вымораживали и перегоияли при атмосферном давлении.

Идентификация пиков отдельных компонентов фламина была проведена путем сравнения их времен удержания с временами удерживания стандартных индивидуальньпс образцов,, а также по увеличению площадей пика компонента во фламине при добавлении к нему стандартного образца.

Оптимизация процесса хроматографического разделения фламина

Вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагид| офуран

70,5г19;4:2,5

71,5;20s5:3,5

72,,5

В области гликозидов 6 пиков с &олъшамк временами удерживания в интервале 30 мин, агликоны не злюируются

Четкое деление гликозидов в Выбрана в качест- интервале 15 мин, агликоны ве системы I не элюируются .

В гликозидной части 6 гдаков мало различающихся по временам удерживания, агликоны не элюируются

Вода ацетонитрил - уксусная кислота

11:6:0 12;7:1

I3s8i2

Агликоны не. элюируются

В области агликонов разделе- Выбрана в качест- ние на пять компонентов , ве системы II

Агликоны образуют 4 пика, близкие по временам удержания .

Формула из обретения Способ количественного определения компонентов фламина путем .хроматографирования его раствора, спектре- фотометрического анализа компонентов с последующим расчетом по. калибровоч- кому графику, отличаю,щийся тем, что, с. целью повышения точности

определения за счет увеличения степени разделения компонентов,, в исследуемый раствор дополнительно вводят внутренний стандарт - салициловую кислоту и хроматографическое разделевне ведут последовательно в двух системах растворителей: I вода - ацето нитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран 7155s20:5;3s5j II вода - ацетонитрил уксусная кислота ,

Таблица 1

713340778

Таблица 2 Расчет содержания кемпферол-3-глюкозида во фламине

Процентное содержание изосалипур- позида во фламине

Отношение площадей пиков изосалипурпо- зида и салици- Ловой кислоты

(SH,/S,,,)

2,48 2,64 2,69 2,66

2,54

Редактор А. Огар

Составитель .А. Агуреев Техред Л.Сердюкова

Заказ 3958/42 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Процентное содержание изосалипурпозида

8,21 8,77 8,94 8,83 8,42

Корректор А. Тяско

Изобретение относится к фармакологии. Цель изобретения - повышение точности способа. Смешивают анализируемый раствор фламина в системе вода - ацетонитрил - уксусная кислота - тетрагидрофуран и раствора салициловой кислоты. Пробу полученной смеси вводят в колонку жидкостного хроматографа. Элюентом для разделения содержащихся во фламине гликоэидов служит система вода - ацетонитрил - уксусная кислота. Для детектирования применяют ультрафиолетовый детектор. По полученным .хроматограммам определяют соотношение площади пика каждого компонента и внутреннего стандарта и рассчитывают содержание отдельных компонентов фламина. 5 табл. ф (Л