Гексапептид,обладающий антипанкреонекротической активностью Советский патент 1987 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

1

Изобретение относится к новому биологически активному соединению гексапепт1оду формулы

Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg,

обладающему антипанкреонекротической активностью, которое может нар 1ти применение в медицине,

Цель изобретения - поиск в области химических соединений пептидной природы, проявляющих высокую анти- панкреонекротическую активность и не вызыва1ои1их побочных реакций.

Карбобензокси-лейцил-аргинин (1).

К раствору 1,74 г (10,00 мМ) арги- )ина в 25 мл диметилформамида,добавляют 4,25 г (11,00 мМ) п-нитрофенило вого эфира карбобензоксиглицина, смесь размешивают при комнатной температуре в печение суток. Диметилфор мамид упаривают, остаток растворяют в 5 мл метанола и добавляют 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе.

Получили (,05 г (96%) продукта с т.пл. 126-130°С; ,46 (н-бута- иол : уксусная кислота : вода 4:1:5) (Л); Ri 0,63 (н-бутанол : пиро- дин : уксусная кислота : вода 10,5 : : 6 : 1 : 7,5) (Б); Rf 0,74 (н-бутанол : уксусная кислота : вода 3: : 1:1) (В); d. -13 (с 1, МеОН).

Карбобензокси-фенилаланил-лейдил- аргинин (2) .

Через раствор 4,05 г (9,61 мМ) (1) в 35 мл трифторуксусной кислоты в течение 1 ч пропускают ток сухого бромистого водорода. Растворитель упаривают, к остатку добавляют 150 м эфира, выпавши осадок отфильтровывают, растворяют в воде и обрабатывают ионообменной смолой Амберлит 1РА-410 (OF1 форма) до отрицательной реакции на ионы брома. Смолу отфильтровывают, промывают на фильтре метанолом, водой, фильтрат упаривают, остатки воды удаляют азеотропной перегонкой с изопропиловым спиртом. Остаток растворяют в 25 мл диметилформамида, к раствору добавляют 4,44 (10,58 мМ) п-нитрофенилоБого эфира карбобензокси-фенилаланина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Диметил формамид отгоняют, остаток растворяю в 5 мл метанола и добавляют 300 мл

13А83АЗ

эфира. Выпавший

осадок отфильтровы

0

вают, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-эксикаторе.

Получают 4,43 г (81Z) продукта с т.пл. рЗ-136°С; ktc г19,3 (с 1, МсОН); R{ 0,J1 (В); Rf 0,63 (Б); (этилацетат: Rf 0,66 пиридин : уксусная к-та : вода 45:20:6:11) (Г).

Карбобензокси-глицил-фенилаланил- -лейцил-аргинин (3).

Продукт получают аналогично (2). Исходя из 4,43 г (7,79 мМ) (2) и 2,83 г (8,57 мМ) п-нитрофенилового

с эфира карбобензоксиглицина получают 4,14 г (85%) продукта с т.пл. 140 - 143 С; - 14,8 (с 1, МеОН); R-f 0,48 (В); R| 0,50 (А); R| 0,60 (Б).

„ Карбобензокси-аланил-глицшт-фе- нилаланил-лейцил-аргИНИН (4).

Продукт получают аналогично (2). Исходя из 0,63 г (1,01 мМ) (3) и 0,38 г (1,11 мМ) п-нитрофенилового

5 .эфира карбобензокси-О-аланина получают 0,56 г (79%) продукта с т.пл. 147 - 149°С.

- 4,0 (с 0,5, ДМФА); Ц 0,33 (В); R| 0,67 (хлороформ : метанол : 32%-ная уксусная к-та 60: :45:20) (D) RJ 0,35 (Г) .

Карбобензокси-о-бензил-тирозил- -аланил-глицил-фенилаланил-лейцил- -аргинин (5).

Продукт получают аналогично продукту (2). Исходя из 0,56, г (0,80 мМ) (4) и 0,43 г (0,88 мМ) п-нитрофенилового эфира карбобензокси-о-бензил- -тирозина получают 0,64 г (84%) продукта с т.пл. 1,50-153 С; 1.1.- 8,1 (с 1, ДМФА); Rf 0,41 (В); Rf 0,52 (Г); R| 0,60 (н-бутанол: пиридин : аммиак конц. : вода 20:12: :3:15) (Е).

Тирозил-аланил-глицил-фенилала- нил-лейцил-аргинин (6).

0,64 г (0,67 мМ) (5) растворяют в 20 мл уксусной кислоты с добавлением ,анизола (30% от объема) и гидрируют в присутствии палладиевого катап за- тора. Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре уксусной кислоты, фильтрат упаривают, остаток переосаждают из метанола (5 мл), эфиром (150 мл), сушат в вакуум-эксикаторе. Полученный продукт наносят на колонку (600x15) с Сефадексом РС-25 и фракционируют в градиенте пиридин- ацетатного буфера 0,05 м - 1,00 м.

5

0

5

0

. .

Получают 0,34 г (65%) продукта с т.пл. 173-176,°С; - 19,1 (с 0,33, H,0); Rf 0,55 (D) , R| 0,54 (Б); Rf 0,41 (E) .

Данные аминокислотного анализа: тирозин 1,18 (1), аланин 1,17 (1), глицил 1,15 (1), фенил-аланил 1,00 (1), лейцил 0,99 (1), аргинин 1,09 (1).

Индивидуальность полученного соединения подтверждена спектром ЯМР, а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пептид элюирювался одним пиком при 42,3% градиента на 14,9 минуте, (колонка 250 X 4,5 мм, Spherisov BODS, 5ju. ; подвижная фаза А:0,05 М КН,РО ; рН 3,0; В: grad 20- 50% В за 20 мин; давление 1500 psi, скорость 1 мл/мин, детекция при 214 мм).

Проведены биологические испытания предлагаемого гексапептида.

Биологическая активность предлагаемого соединения была исследована в опытах на собаках на модели экспериментального острого панкреатита, вызванного введением желчи в вирсунгов проток.

Все эксперименты проводили в состоянии животных натощак, что необходимо для синхронизации экзокрин- ной деятельности поджелудочной железы.

Перед введением инфицированной желчи в вирсунгов проток забирали фоновые пробы крови, мочи и панкреатического сока для специальных энзи- мологических исследований. После введения желчи в вирсунгов проток эти же биологические пробы забирали ежечасно, до окончания эксперимента.

Для диагностики развивающегося панкреатита и оценки выраженности наступающих деструктивных изменений в экзокринной ткани и энзимной токси мии исследовали активность следующих панкреатических ферментов: а-амила- зы по Каравею, липазы по Найтельсону суммарной эстеразной активности по Траушхольду и Берне, антитриптическо активности по Пасхиной, трансамиди- назы по Карелину.

В контрольной группе экспериментов участвовали три собаки. Им создавали только экспериментальный панкреатит без лечения предлагаемым гекса- пептидом, острый опыт длился 6-8 ч,

20

48343

после чего собаки забивались внутри- сердечн 11м введением гексенала.

Активность панкреатических ферментов в крови, моче и панкреатическом соке измерялась в процессе развития экспериментального панкреонекроза для диагностики развивающегося заболевания до начала его лечения. После

.Q развития панкреонекроза и начала введения препаратов эти измерения проводились только в сыворотке крови, так как при прогрессирующем панкреонек- розе имеет место уменьшение диуреза вплоть до полной анурии, а также резкое уменьшение количества панкреатического сока. Таким образом, сравнительное количественное влияние различных препаратов на ферментативную активность в условиях развившегося панкреонекроза возможно только в крови. Эти данные приведены в табл. 1-3,

Сравнение предлагаемого гексапеп25 тида с ближайшими структурными аналогами, такими как глюкагон,соматоста- тин или карбазаты пептидов, нецелесообразно, так как эти препараты значительно уступают по эффективности

oQ фторафуру и не нашли клинического применения при заболеваниях поджелудочной железы.

Как следует из приведенных в табл. 1 - 3 данных, предлагаемый

препарат обладает существенными преимуществами перед фторафуром и конт- рикалом по влиянию на показатели активности ферментов в сыворотке крови в условиях развившегося панкреонекро40 за. При введении предлагаемого соединения резко снижается активность липазы, суммарная эстеразная активность крови, отмечается трехкратное повьппе- ние антитриптической активности. Это

45 свидетельствует об уменьшении выброса в кровь активных панкреатических ферментов с параллельным нарастанием уровня их ингибиторов. Снижение концентрации в крови фракции средних

0 молекул свидетельствует о падении токсемии, снижении интоксикации. При введении фторафура эти показатели практически не изменяются в то время как инфузии контрикала не предот5 вращают продолжающееся нарастание активности липазы в эстераз, а также уровня средних молекул в крови.

Проведены морфологические исследования экзокринной ткани поджелудочной

железы при экспериментальном геморрагическом паикреопекрозе до введения предлагаемого гексапептида и после его введения.

После введения инфицированной желчи в вирсунгов проток очаговый панк- реонекроз с выраженным интератициаль ным отеком развивается в ближайшие 30 мин.

Через 2 ч развивается диффузный геморрагический панкреонекроз. В ос- нонном это внутридольковые поражения поджелудочной железы. Характерным является геморрагическое пропитывание ЗОИ некроза, отек и кровоизлияния межацинарных пространств с выраженны ми наруи1е)1иями в системе микрогемо- ппрк уляторного русла - эритростазы, агрегация форменных элементов и мик- ро громбозы капиллярного и венулярно- го зт епа.

Макроскопически через 4-6 ч после воспроизведения панкреатита поджелудочная железа животных выглядит диф- фузно отечной с единичными стеатонек розами под капсулой и множественными меж- и В11утр1щольковыми кровоизлияниями .

Гистологически рисунок долек нарушается за счет массивных дольковых и мозаичных внутридольковых некрозов. В зонах некроза наблюдаются массивные меж-, внутриацинар)ые и мери- васкулярн1ле кровоизлияния, рисунок апинусов полностью нарушается, лишь контуры их сохраняются за счет цельности базальньгх мембран. В просветах таких ацинусов можно различать фрагменты некротизованных клеток и еди1П)чные лейкоциты.

В пограничных с некрозом зонах существуют выраженные признаки дис- комплексации ацинарных клеток (АК), внутриклеточные и клеточные некрозы без отгран11чения их от жизнеспособ- fibix участков цитоплазмы.

В зонах некроза полностью нарушается целостность клеточных мембран, органеллы ЛК предоставляются вакуо- лизированными мембранными структурами, ядра находятся в состоянии пикно за или лизиса с сохранением глыбок конденсированного хроматина среди клеточного детрита.

Морфологи ческие изменения экзо- кринной ткани поджелудочной железы при экспериментальном геморраг ичес- ком панкреонекрозе после лечения

5

5

0

5

0

5

0

5

предлагаемым гексапептидом показали, что на ранних сроках лечения гексапептидом изменяется характер панк- реонекроза, т.е. отсутствуют все морфологические признаки, характеризующие прогрессирование процесса, отсутствуют и острые сосудистые изменения такие как стазы, микротромбозы. Пре- .обладает коагуляционный паренхимный некроз. Сохраняется кровоток в системе микроциркуляторного русла как в неповрежденной паренхиме, так и в зонах паренхимного некроза, что особенно важно для последующей регенерации и элиминации некротически измененных тканей. Сохраняются признаки нарушения дренажной функции секрета по протоковой системе, отсутствуют четкие признаки снижения секреторной активности неизмененной ацинарной паренхимы. Отсутствуют признаки расширения центроацинарных протоков и переполнения секретом протоков различных калибров. Подобные изменения указывают на сохранение нормальной дренажной функции протоковой системы и выброса секритируемых ферментов в просвет двенадцатиперстной кишки.

Через сутки после лечения экспериментального панкреатита внутривенным введением гексапептида в поджелудоч- ной железе сохраняется картина смешанного панкреонекроза.

Через сутки после лечения отмечается положительная динамика в морфологии геморрагического панкреонекро- за. Отсутствуют признаки меж- и внут- ридольного отека, воспаления интеро- тиции. Лишь в отдельных участках, в зонах единичных стеатонекрозов, имеются выраженный демаркационный воспалительный вал и воспалительная инфильтрация, распространяющаяся на близлежащие междольковые пространства. Имеют место и ареактивные стеато- некрозы.

Отсутствуют изменения в системе макро- имикрогемациркуляторного русла.

Сохраняются признаки мелкооча гово- го геморрагического панкреонекроза. Особенностью очагов некроза является четкое отграничение их от неповрежденной паренхимы. Отсутствие некротического детрита в мелких очагах поражения или сохранение его в крупномасштабных очагах повреждения с незначительной воспалительной инфильтрацией этих зон. В отдельных очагах

7

некроза выявляются свежие кровоизпия- ния ,

Гистохим 1ческое исследование поджелудочной железы выявило снижение секреторной активности, отсутствие дистрофических изменений вне поврежденной паренхимеJ восстановление выделения секрета в протоковую систему с некоторым нарушением дренажной функции крупных протоков.

При лечении геморрагического панк реонекроза предлагаемым гексапепти- дом через 7 сут наблюдается полная организация очагов некроза в пиде недифференцированных эпителиальных комплексов или с началом ацинарной дифференциации. Отсутствуют признаки меж- и внутридолькового склероза. Через 14 сут после начала лече)1ия наступает полная регенерация ацинарной ткани с компенсаторной гиперфункцией aцинapFIыx клеток без каких-либо признаков повреждения органа и воспаления, наблюдается выраженная тенденция к нормализации аминолитической, липолитической и протеолитической активности поджелудочной железы.

Изучение острой токсичности гек- сапептида было установлено, что его состагляет 150 мг/кг, терапевтическая доза его 0,3 мг/кг, т.е. превышает летальную дозу в 500 раз. Предлагаемый гексапептид не изменяет клеточный состав крови, т.е. не угнетает процессы кровотворения и не вызывает патологических реакций со стороны иммунной системы.

Действие предлагаемого гексапепти да сравнивают на той же модели острого панкреатита с действием широко используемых препаратов - фторафура и контрикала менее токсичных соединений (например, для фторафура 750 мг/кг). В то же время терапевтическая доза последнего 5 мг/кг ( превышает терапевтическую дозу в 150 раз).

483438

При использовании фторафура на ранних сроках лечения сохраняется большая воспалительная инфильтрация зон некрозаинтерстиция.

При более поздних сроках лечения масштабы некроза экзокрнмной ткани уменьшаются, но сохраняется массивная воспалительная инф-цльтрация ин1Q терстиция, отмечается появление множественных очагов жирового панкрео- некроза с лейкоцитарным валом (про- цесс идет по типу микроабсцедирова- ния) и развитие начальных явлений

1г, склероза интерстиция. Через 7 сут после начала лечения развивается выраженный фиброз поджелудочной железы с разобщением долек на фрагменты. Регенерация поджелудочной железы не20 полноценная, имеет место развитие недифференцированной эпителиальной ткани.

При лечении экспериментального острого панкреатита контрикалом на ранних сроках лечения наблюдается прогрессирование геморрагического некроза с геморрагической имбибицией интерстиция и зон некроза. Контрикал уменьшает нарушения внутриорганной микрог емолимфоциркуляции, в отдельных опытах снимает сосудистые тромбозы, однако животные погибают через 8- 10 ч от начала опыта вследствие прогрессирующего некроза экзокринной паренхимы и энзимной токсемии.

Таким образом, предлагаемый гексапептид при остром панкреатите эффективно угнетает синтез панкреатических ферментов, улучшает внутриор- ганное крово- и лимфообращение, ограничивает площадь некротических изменений экзокринной паренхимы и при повторных парентеральных введениях приводит к полной регенерации поджелудочной железы без остаточных признаков некроза и воспалительных явлений.

0

5

0

5

Изменение ферментной активности и кининов в сыворотке крови при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе после внутри- венного введения контрикала в дозе 10000 АТрЕ в час (3 собаки)

Активность альфаамилазы,

Изменение ферментной активности и кининов в сыворотке крови при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе после внутривенного введения фторафура в дозе 5 мг/кг (3 собаки)

Средние молекулы в условных единицах оптической плотности

0,365+0,032

Таблица 2

0,А02±0,026 0,396+0,073

Изменение ферментной активности и хининов в сыворотке крови при экспериментальном геморрагическом панкреонекрозе после внутривенного введения предлагаемого гексапептида в дозе 0,3 мг/кг

(7 собак)

Активность альфаамилазы

Редактор Н. Киштулинец

Составитель И. Волкова

Техред М. Ходанич Корректор М.Максимишинеи

Заказ 5163/24Тираж 347Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по. делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1348343

12 Таблица 3

Гексапептид формулы tyr-Ala-Gly- -Phe-Leu-Arg, обладающий антипанкре- онекротической активностью. со . 00 со NU со