Способ получения аденовирусных антигенов Советский патент 1988 года по МПК A61K39/00 C12N7/00 

1

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антигенных препаратов аденовирусов.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Пример 1, Монослой перевивае- Q буфером (рН 7,2), Далее колонку промой культуры клеток человека линии Нер-2 выращивают во вращающихся бутылях объемом 2 л в устройстве для роллерного культивирования клеток. Для вьфащивания клеток используют среду 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота. На сформированный монослой клеток Нер-2 (20 бутылей по 60 млн. клеток) наносят инфекционный аденовирус человека типа 1 (Adhi) в дозе 0,05 бляшкообразующих.единиц на клетку в полном объеме поддерживающей среды (100 мл среды 199 с 2% ами- нопептида на бутыль). Через 72 ч, когда весь монослой поврежден цито- патическими изменениями, среду культивирования сливают, а в бутыли добавляют по 10 мл Юм натрий-фосфатного буфера, рН 7,2 и снимают клетки со стекла с одновременньм их лизисом путем встряхивания.

Суспензию лизированных клеток (общий объем 120 мл) гомогенизируют в механическом ножевом размельчителе в течение 2 мин, после чего добавляют

200 мл 5 М раствора NaCl и дополнительно гомогенизируют 2 мин. К гомо- генату добавляют 200 мл четыреххло- ристого углерода и встряхивают на лабораторном щейкере в течение 5.мин, после чего смесь разделяют центрифугированием в течение 15 мин, при 1500 об/мин. Верхнюю водную фазу (объем 395 мл) собирают и объединяют со средой культивирования (объем 950 мл). Объединенную фракцию подкисляют до рН 6,4 добавлением 1 М NaHjPOi, и наносят на колонку (диаметр 5 см, высота слоя сорбента 6 см) содержащую фенилсефарозу CL-4B (Фар- мация, Швеция) и уравновешенную 10 М натрий-фосфатным буфером (рН 6,4), со скоростью 1400 мл/ч. Колонку промывают с той же скоростью 1 л ЮМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,2), после чего элюируют антиген 30%-ным этанолом на 10 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,2).со скоростью 200 мл/ч, В элюате регистрируют наличие белков

3643422

по поглощению при 280 нм. Белковый пик объединяют в одну фракцию (объем 185 мл) и подвергают дальнейшей очистке .

Для этого элюат с фенилсефарозы наносят со скоростью 200 мл/ч на колонку ДЕАЕ-сефарозы (2,6 х 6 см), уравновещенную 10 М натрий-фосфатным

b

мывают с такой же скоростью 200 мл 10 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего 0,2 М NaCl, Элюцию антигена с ДЕАЕ-сефарозы проводят

линейным повышением концентрации

NaCl от 0,2 до 0,4 М на 10 М натрий- фосфатном буфере (рН 7,2). Общий объем градиента 160 .мл, скорость элюции 30 мл/ч. Фракции объемом 3 мл собирают с помощью автоматического коллектора фракций, В полученных фракциях определяют содержание антигена с помощью ракетного иммуноэлектрофореза в агарозе с антисывороткой против

гексона аденовируса обезьян Ad sim 16, содержание суммарного белка определяют методом Лаури и степень чистоты антигена - с помощью дискэлектрофо- реза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия,

Результаты получения антигена проиллюстрированы в таблице.

5

g.

Выход очищенного антигена Ad hi соответствует 16 мг на 10 клеток (таблица, пункт 5), тогда как по известному способу максимальный выход составляет 9 мг на 10 клеток.

Кроме основной фракции очищенного

0 антигена (таблица, пункт 5 ) ,; на последнем этапе получают его дополнительные фракции, содержащие частично очищенный антиген (таблица, пункты 5 и 5 ), который может быть получен в

g очищенном состоянии путем повторной хроматографии на анионообменнике (пример 2). Аналогичньм способом могут быть очищены антигены аденовирусов обезьян и крупного рогатого скота,

П р и М е р 2, Монослой первичной культуры клеток почки зеленой мартышки (ПЗМ) выращивают в плоских куль- туральных флаконах объемом 1,5 л в среде, указанной в примере 1, На сформированный слой клеток ПЗМ (60 сосудов по 25 млн, клеток) наносят инфекционный аденовирус низших обезьян SA7 (Ad sim 16 (клон МБ-230) в

2слетку в полном объеме поддерживающей среды (150 мл среды, согласно примеру 1, на флакон). Через 96 ч культу- ральную среду сливают, клетки снимают и экстрагируют из них антиген, как указано в примере 1. Хроматографичес- кую очистку антигена из объединенной фракции среды культивирования и эк- стракта клеток ведут, как указано в примере 1, за исключением того, что объединенную фракцию подкисляют до рН 6,0, а размеры хроматографических

(объем 25 мл) и подвергают лиофиль- ной сушке. Выход антигена 80 мг, что соответствует 53 мг на 10 клеток.

содержание гексона Ad sim 16 - 97%, Примерз. Монослой культуры клеток МДВК выращивают во вращающихся бутылях объемом 500 мл в устройстве 10 для роллерного культивирования клеток в среде, указанной в примере 1, Заражают клетки (20 бутылей по 20 млн. клеток) препаратом инфекционного аденовируса крупного рогатого скота колонок увеличивают (высота слоя сор- is Ad ) (0,01 БОЕ/клетку) в поддер- бента соответственно 10 и 15 см для живающей среде (50 мл на флакон). Че- фенилс ефарозы и ДЕАЕ-сефарозы) . Ко- рез 120 ч среду сливают, а антиген лонку ДЕАЕ-сефарозы промывают 500 мл из клеток экстрагируют, как указано 10 М натрий-фосфатного буфера (рН в .примере 1, Хроматографическую очи- 7,2), содержащего 0,07 М NaCl, а элю- 2о стку антигена проводят, как описано цию ведут градиентом концентрации NaCl от 0,07 до 0,2 М на 10 М натрий- фосфатом буфере (общий объем градиента 350 мл). Собирают фракции объемом 7 мл. Пик очищенного антигена (фракции 25-36) объединяют. Фракции частично очищенного антигена (21-24 и 37-42) объединяют, (общий объем 68 мл), разбавляют до 200 мл 10 М натрий-фосфатным буфером и наносят на колонку 2,6 х 8 см ДЕАЕ-сефарозы, уравновешенной ЮМ натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,07 М NaCl. Колонку промывают 150 мл того же буфера, после чего элюируют антиген линейным градиентом концентрации NaCl 0,07-0,2 М на ЮМ натрий-фосфатном ,20 мг/Ю клеток), чистота 96%.

Предлагаемый способ получения антигена обеспечивает повышение вы- 40 хода препарата в 2-5 раз по сравнению с известным способом. . Полученные предлагаемым способом

антигены аденовирусов сохраняют пол- - ную антигенность и иммуногенность и 45 могут применяться в качестве, диагностических и вакцинных препаратов.

в примере 1, за исключением тоЬо, что элюцию антигена с фенилсефарозы проводят 20%-ным изопропанолом на 10 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,2). На

25 этапе ДЕАЕ-сефарозы используют концентрации NaCl, указанные в примере 2. Очищенный антиген Ad bos 3 (объем 38 мл) концентрируют. Для этого к препарату добавляют 100 мл охлажден30 ного до ацетона, смешивают и оставляют смесь на 1 ч при -20 С. После этого осадок антигена отделяют центрифугированием (20 мин при 3000 об/мин при О с) и растворяют в

.- 3 мл 0,15 М NaCl. Выход антигена оЬ .

Ad bos 3 - 81 мг (что соответствует

буфере (рН 7,2). Общий объем градиента 200 мл, собирают фракции по 5 мл. Очищенный антиген выходит во фракциях 21-26. Эти фракции объединяют с очищенным антигеном с 1-й ко- ,лонки ДЕАЕ-сефарозы, Общий объем препарата, очищенного гексонового антигена 110 мл, содержание гексона Ad sim 16 т 84 мг.

Для удаления солей и концентрирования очищенного антигена проводят хроматографию на фенипсефарозе. Для этого объединенную фракцию наносят . на колонку фенилсефарозы (1,6 х X 12 см), уравновешенной 10 М натрий- фосфатным буфером (рН 6,4), со скоростью 10 мл/ч. Колонку промывают с

Формула изобретения

gQ Способ получения аденовирусных антигенов, включающий выращивание аденовирусов в культуре клеток, отделение зараженных клеток от культу- ральной жидкости,- разрушение клеток той же скоростью 50 мл 5 М NH COOCH, gg путем лизиса и извлечение аденовирус- после чего элюируют сконцентрирован- ного антигена экстракцией буферным ный антиген 30%-ным этанолом на дис- раствором хлорида натрия, обработку тиллированной воде со скоростью экстракта органическим растворителем 20 мл/ч. Белковый пик (по поглощению с последующей очисткой и концентри(объем 25 мл) и подвергают лиофиль- ной сушке. Выход антигена 80 мг, что соответствует 53 мг на 10 клеток.

содержание гексона Ad sim 16 - 97%, Примерз. Монослой культуры клеток МДВК выращивают во вращающихся бутылях объемом 500 мл в устройстве 10 для роллерного культивирования клеток в среде, указанной в примере 1, Заражают клетки (20 бутылей по 20 млн. клеток) препаратом инфекционного аденовируса крупного рогатого скота is Ad ) (0,01 БОЕ/клетку) в поддер- живающей среде (50 мл на флакон). Че- рез 120 ч среду сливают, а антиген из клеток экстрагируют, как указано в .примере 1, Хроматографическую очи- о стку антигена проводят, как описано ,20 мг/Ю клеток), чистота 96%.

в примере 1, за исключением тоЬо, что элюцию антигена с фенилсефарозы проводят 20%-ным изопропанолом на 10 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,2). На

5 этапе ДЕАЕ-сефарозы используют концентрации NaCl, указанные в примере 2. Очищенный антиген Ad bos 3 (объем 38 мл) концентрируют. Для этого к препарату добавляют 100 мл охлажден0 ного до ацетона, смешивают и оставляют смесь на 1 ч при -20 С. После этого осадок антигена отделяют центрифугированием (20 мин при 3000 об/мин при О с) и растворяют в

.- 3 мл 0,15 М NaCl. Выход антигена Ь .

Ad bos 3 - 81 мг (что соответствует

Формула изобретения

5 . 136Л3426

рованием сорбционной хроматографией, ционную хроматографию проводят с ис- отличающийся тем, что, с пользованием фенилсефарозы с рН 6,0- целью повышения выхода целевого про- 6 при этом элюцию осуществляют дукта и упрощения способа, при извле- 30%-ным раствором этанола или 20%-ным чении аденовирусного антигена осуще- раствором изопропанола с последующей ствляют дополнительную экстракцию сорбцией элюэнта на ДЕАЕ-сефарозе и 5 М раствором хлорида натрия, после элюцией антигена 10 М натрий-фосфат- обработки экстракта органическим рас- ного буфера рН 7,2 с линейным повыше- творителем его дополнительно объеди- ig нием концентрации в нем хлористого няют с культуральной жидкостью, сорб- натрия от 0,2 до 0,4 М.

Изобретение относится к области медицинской и ветеринарной вирусологии, в частности к технологии получения антигенных препаратов аденовирусов . Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта и упрощение способа получения аденовирусных антигенов. Для этого аденовирусы выращивают в культуре клеток человека и животных, отделяют зараженные клетки от культуральной среды, извлекают антиген дистракцией сначала буферным раствором хлорида натрия, а затем дополнительной экстракцией 5М раствором хлорида натрия, после чего экстракт обрабатывают органическим растворителем и дополнительно объединяют с культуральной жидкостью, а очистку и концентрирование осуществляют двухступенчатой сорбционной хроматографией сначала на фенилсефа- розе, а затем на ДЕАЕ-сефарозе. В результате указанных манипуляций достигается высокая частота аденовирусного антигена (), а его выход увеличивается в 1,5-2 раза. 1 табл. е (Л W Од Од 4) 00 4

Среда культивирования 950 3230 23

Экстракт клеток395 350 25

Объединенный исходный препарат . 1345 3580 48

4 Элюат с фенилсефарозы 185 292

5 Элюат с ДЕЛЕ-;

сефарозы а) фракции

25-27 8,5 14,0 7,6 51 15

20,5 20,0 19,2 95 40

17,0 27,8 10,1 36 21

г) сумма

(а + б + в) (46) (61,8) (36,9) (74) (76)

0,7148

6,952

1,3100

14,388