Способ определения сократимости кардиомиоцита Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики оо стояния миокарда на Клеточном уровне, и может быть использовано в кар- диологии для диагностики сердечнососудистых заболеваний, в физиологии для исследования механизмов регуляции сократимости миокарда и в фармакологии для определения механизмов ю ействия биологически активных веществ.

Цель изобретения - -повышение точ- кости способа за счет возможности исследования в физиологических уело- 15

ВИЯХ.

Способ определения сократимости кардиомиоцита осуществляют следующим образом.

Каплю суспензии ферментативно вы- 20 еленных кардиомиоцитов помещают в прозрачную перфузионную камеру I (фиг. 1), размещенную на предметном столике микроскопа. Выбирают неповрежденный кардиомиоцит, подводят к 25 одному его торцу закрепленный в микроманипуляторе 2 стержень 3 с раздвоением на конце и с капелькой биоогического клея в просвете раздвоеия. Раздвоение устанавливают над 30 торцом кардиомиоцита 4 и опускают стержень 3 с помощью микроманипулятоа 2 так, чтобы клей в просвете развоения стержня 3 охватил торец кар- иомноцита 4. Через 3-5 мин, необ- ходимых для надежной полимеризации клея, к другому торцу кардиомиоцита подводят второй стержень 5 с раздвоением на конце и с капелькой биологического клея в просвете раздвое- 40 ния. Стержни 3 и 5 могут быть изготовлены путем скручивания из тонкой проволоки диаметром не более 10 мкм. На конце стержня 5 имеется арик 6, которьй проще всего изгото д вить путем нанесения на конец стержня капельки клея. Диаметр шарика 6 составляет 5-10 диаметров стержня 5, а длина стержня 5 - 10-15 диаметров щарика 6. Стержень 5 .зажат в микрозажиме 7, закрепленном во втором микроманипуляторе 8. Раздвоение устанавливают над вторым торцом кариомиоцита 4 и опускают стержень 5 с помощью |микроманипулятора 8 так, чтобы клей охватил тОрец кардиомиоцита 4. Через 5 мин после полимеризации клея освобождают микрозажим 7 и с помощью микроманипулятора 2 пе50

5

0 5 0 0 д

0

ремещают кардиомиоцит 4 со стержнями 3 и 5 влево таким образом, чтобы шарик 6 зашел в цилиндрический канал 9. Диаметр цилиндрического канала 9 составляет ,1-1,5 диаметра шарика 6. Затем по цилиндрическому каналу создают поток жидкости, обеспечивая усилие на кардиомиоцит. Чрезмерное растяжение кардиомиоцита предотвращается упором бокового отвода стержня 5 в утенку цилиндрического канала 9. Затем через платиновые электроды 10 и 11 производят электростимуляцию кардиомиоцита 4 импульсами длительностью 10-1-5 мс напряжением 30-50 В и частотой 0,1-0,6 Гц. Процесс сокращения кардиомиоцита 4 регистрируют на кинопленку путем съемки через микроскоп.

П р и м е р 1. Определение скоростной компоненты сократимости кар- диомиоцита крысы.

Брали крысу линии Вистар весом 280 г , производили ее декапитацию, вскрывали грудную клетку и отсекали сердце на уровне дуги аорты и предсердий. Получение кардиомиоцитов производили по стандартной методике Айзенберга. Проводили ретроградную перфузию изолированного сердца по методике Лангендорфа под давлением 80 мм рт.ст. бескальциевым раствором Тироде в течение 15 мин, подключив сердце к специальной перфузион- ной системе. В течение 15 мин пер- фузировали сердце при том же давлении стандартным раствором №роде с добавлением 0,1% коллагеназы. Сердце отсоединяли от перфузионной системы, рассекали на куски размером 2-4 мм, которые помещали в камеру с мещалкой и с нормальным раствором Тироде плюс 0,1% коллагеназы на 15 мин, затем сливали раствор с поврежденными при рассечении сердца кар- диомиоцитами и наливали свежий. Через 30 мин полученный раствор сливали и центрифугировали при 10 g в течение 10 мин. Раствор сливали, а в пробирку с кардиомиоцитами наливали нормальный раствор Тироде без кол- лагеназы.

Каплю суспензии кардиомиоцитов помещали в специальную прозрачную перфузионную камеру, размещенную на предметном столике микроскопа фирмы Карл Цейс. Выбирали неповрежденный кардиомиоцит (кардиомиоцит считался

неповрежденньм, если отсутствовали его спонтанные сокращения и нарушения формы) длиной 75 мкм и шириной 18 мкм. Подводили к торцу кардиоми- оцита жестко закрепленный в микроманипуляторе рычаг с раздвоенньм концом, изготовлен1а1Й скручиванием из медной проволоки диаметром 10 мкм с капелькой биологического цианакри латного сосудистого клея внутри раздвоения. Раздвоение устанавливали над торцом кардиомиоцита и опускали рычаг с помощью микроманипулятора так, чтобы клей охватьшал кардиоми- оцит. Через 5 мин клей полимеризовал- ся, после чего к другому торцу кар- диомиоцита подводили стержень с раздвоением на конце, в котором помещали капельку биологического клея. . Стержень изготавливали из медной проволоки диаметром 10 мкм путем скручивания таким образом, чтобы образовать боковой отвод на расстоянии 200 мкм от разветвления длиной 100 мкм. За отводом стержень имел длину 1200 мкм. На конце стержня имелся шарик диаметром 75 мкм, полученный путем нанесения капельки эпоксидного клея. Боковой отвод размещали в зажиме, установленном на микроманипуляторе. Раздвоение устанавливали над свободным концом кардиомиоцита и опускали стержень так, что клей охватывал торец кардиомиоцита. Через 5 мин после затвердевания клея подводили сбоку цилиндрический канал внутренним диаметром 100 мкм так, чтобы от торца канала до бокового отвода было расстояние 200 мкм. Затем разжимали зажим, освобождая боковой отвод, и удаляли зажим из поля зрения микроскопа с помощью микроманипулятора. К цилиндрическому каналу подавали разрежение нужной величины. Шарик стержня предварительно был откалиброван таким образом, что было известно, какое . усилие на кардиомиоцит создается при создании заданного разрежения. Калибровка шарика проводилась с помощью торсионных весов.

Устанавливали разрежение, достаточное для того, чтобы боковой отвод прикоснулся к торцу цилиндрического канала. Оно равнялось 4,2 мм рт.ст.

Затем подаваши через платиновые электроды, расположенные на расстоянии 50 мкм от кардиомиоцита, электрические импульсы длительностью 15нс

напряжением 36 В и частотой 0,5 Гц, Одновременно цилиндрический канал перекрывали ниже шарика по потоку

так, что усилие, приложенное к кар- диомиоциту, становилось равным нулю. Происходило сокращение кардиомиоцита, которое регистрировалось на киноплен™ ку камерой Красногорск, Максималь-

ная скорость сокращения кардиомиоцита равнялась 2jl 1/с (180 мкм/с), что свидетельствует 6 хорошей скоростной кo ffloнeйтe сократимости миокарда (максимальная скорость- сокращения папиллярной мьшцы крысы в норме при 22 С равняется 1,7 + 0,2 /с). Пример 2. Определение силовой компоненты сократимости кардиомиоцита крысы.

Брали крысу линии Вистар весом 260 г. Ферментативное вьвделение кар диомиоцита производили аналогично примеру 1. Бьш выбран кардиомиоцит длиной 67 мкм и шириной 16 мкм. При

крепление кардиомиоцита производили аналогично примеру 1.

Устанавливали разрежение 3,4 мм рт.ст. до касания боковым отводом торца цилиндрического кана-

ла, прикладывали электрические импульсы длительностью 10 мс, напряжением 42 В и частотой 0,5 наблюдали сокращения.

Затем устанавливали заведомо большое разрежение 120 мм рт.ст.

так, что клетка не могла сократиться. После этого постепенно умень шали разрежение до появления первых признаков перемещения мышцы, которое наблюдалось при разрежении 56 мм рт.ст. Это соответствовало усилию 0,047 мг и напряжению 0,23 г/мм , что соответствует о хорошей силовой компоненте сократимости миокарда. (Напряжение, развиваемое папиллярной мьшцей крысы в норме, составляет 0,1-0,15 г/мм).

Пример 3.. Определение силовой компоненты сократимости кардиомиоцита крысы после ишемического повреждения.

Брали крысу весом 250 г.Фермента- тивное выделение и прикрепление диомиохщта производили аналогично примеру 1, однако после перфузии бескальциевьм раствором производили остановку перфузии на 10 мин для соз- создания ишемии. Был выбран кардно- миоцит размером 72x18 мкм.Измеряли

максимальное изометрическое напряжение аналогично примеру 2, которое оказалось равным 0,019 мг, что соответствовало напряжению О,08 г/мм . Это свидетельствует о том, что ише- мическое повреждение существенно снизило сократительную способность кардиомиоцита.

Пример 4. Определение дисперсии сократительных свойств кар- диомиоцитов крысы.

V К крысы линии Вистар весом 270 г в соответствии с примером 1 получали кардиомиоциты. Измерения максимального изометрического усилия кар- диомиоцитов проводили в соответствии с примером 2. Было определено, что напряжение, развиваемое кардиомиоци- тами крысы, равно 0,18 + 0,01 г/мм. Это говорит о малом разбросе сократительных свойств кардИомиоцитов крысы в норме.

П р и м е р 5. Определение влияния биологически активных веществ на сократимость сердечной мышцы крысы.

У крысы весом 260 г был получен кардиомиоцит длиной 76 мкм и шириной 20 мкм в соответствии с примером 1. Прикрепление кардиомиоцита и измерение максимального изометрического усилия производили аналогично примеру 2. Измеренное усилие равнялось 0,038 мг. Затем в раствор добавляли раствор дигоксина из расчета 5 х X 10 г/л, прсле чего вновь измеряли максимальное изометрическое уси лие, которое оказалось равным 0,051 мг, т.е. на 37% больше. Это говорит о существенном положительном изотропном влиянии дигоксина на сократительную активность кардиомиоцита крысы.

Дисперсии измеряемых характеристи уменьшаются по сравнению с прототипом. Если при F a6oTe по известному способу среднеквадратичный разброс

максимальной скорости сокращения больше 20%, то при использовании предлагаемого способа этот разброс не превьш1ает 5%. Повьшение точности достигается также за счет того, что в предлагаемом способе кардиоми- оцит сокращается в физиологических условиях, под нагрузкой, составляющей 25-30% от максимального изометрического усилия, в то время как нагрузка на кардиомиоцит в известном способе равна нулю.

15 Формула изобретения

0

5

Способ определения сократимости кардиомиоцита путем его ферментативного вьщеления, закрепления в камере, заполИенной буферным раствором, .. электрической стимуляции с последующей регистрацией сокращения, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности способа за счет возможности исследования в физиологических условиях, при закреплении кардиомиоцита к одному его торцу подводят стержень с раздвоением на конце и каплей биологического клея в просвете раздвоения, вьщержи- вают в течение 3-5 мин, к другому торцу кардиомиоцита подводят фиксированный в зажиме стержень с раздвоением на одном конце и каплей биологического клея в просвете раздвоения и шариком на другом конце, вновь выдерживают в течение 3-5 мин, осво- боявдают второй стержень, перемещая первый стержень, вводят шарик в цилиндрический канал, затем дополнительно создают нагрузку на кардиоми- оцит потоком раствора, пропускаемого в камере через цилиндрический канал, при этом диаметр шарика составляет 3-10 диаметров второго стержня диаметр цилиндрического канаЛа - 1,1- 1,5 диаметра шарика, а длина второго стержня - 10-15 диаметров шарика.

5

0

5

0

w

/

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в кардиологии для диагностики состояния миокарда на клеточном уровне сердечно-сосудистых заболеваний и в фармакологии для определения механизмов действия лекарственных веществ. Цель изобретения - пс ыаение точности способа путем определения оценки сократимости кардиомиоцита за счет измерения параметров сокращения при физиологически нормальных условиях. Для его ферментативного выде- ления, прикладывания стимула и визуальной оценки сокращения после вьще- ления кардиомиоцита к одному его концу прикрепляют закрепленный в держателе рычаг, к другому концу - стержень с осесимметричным телом на конце, заводят последнее в цилиндрический канал, а нагрузку на кардиомиоцит задают путем создания потока жидкости в канале, кроме того, прикрепление к кардиомиоциту рычага и стержня производят путем подведения к кардиомиоциту жестко закрепленного в микроманипуляторе рычага с развоен- ным концом и капелькой биологического клея внутри раздвоения с установкой просвета раздвоения над концом кардиомиоцита и последующим опусканием рычага и подведения через 3-5 мин к кардиомиоциту стержня с заполненньм клеем раздвоением на одном конце с осесимметричным телом на другом и с боковым отводом, закрепленным с возможностью освобождения в зажиме другого манипулятора, с установкой просвета раздвоения над другим торцом кардиомиоцита, с последующим опусканием стержня и его освобождением через 3-5 мин. Кроме того, рычаг и стержень изготовлены скручиванием из тонкой проволоки, 1 ил. i л с 00 vj со 00

1

I

NT

Л