ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA SCOTTII - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОГО БЕЛКА Советский патент 1995 года по МПК C12N1/22 C12N1/22 C12R1/72 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к переработке предгидролизатов сульфат-целлюлозного производства, и представляет собой новый штамм дрожжей, который может быть использован для получения кормового белка из образующихся при производстве целлюлозы жидких отходов.

Целью изобретения является получение нового штамма дрожжей, способного более активно развиваться при повышенном содержании ингибиторов роста в субстрате, обладающего высокой скоростью роста (0,35 ч^-1), способного синтезировать белковую массу с повышенным содержанием сырого протеина 55-57%
Штамм Candida scottii получен как новая спонтанно появившаяся культура в лабораторном ферментере при биоокислении после дрожжевой бражки и селекционирован в условиях непрерывного культивирования на предгидролизате с содержанием РВ 1,5% при высоком коэффициенте скорости разбавления среды без дополнительной подготовки субстрата с повышенной концентрацией ингибитора роста (фурфурола 0,1%). Штамм идентифицирован по определению (Loodder I.) как относящийся к виду Candida scottii. Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика" за N ВКПМ У-546 (авторский номер БК-85).

Морфологические признаки штамма. На солодовом сусле (10^оБ) односуточная культура, выращенная в термостате при температуре 36^оС, имеет клетки мелкие и средние (длина 8,41 мкм, ширина 4,54 мкм, объем 99,8 мкм³).

Дрожжи Candida scottii БК-85 размножаются вегетативно путем почкования. При почковании клетки не разъединяются, а продолжают образовывать все новые и новые почки, из которых складывается псевдомицелий. Образование псевдомицелия изучено на картофельно-глюкозном агаре методом пластинок, а также на солодовом сусле-агаре и агаризированном предгидролизате. Обильный рост псевдомицелия наблюдается в аэробных условиях, т.е. на стеклах со средой из картофельно-глюкозного агара вне покровных стекол. На основном стволе псевдомицелия располагаются супротивно и (или) мутовчато мелкие, овальные, круглые бластоспоры, аскоспоры отсутствуют.

Культуральные свойства. При посеве штрихом на скошенном солодовом сусле-агаре, инкубировании в термостате при температуре 25^оС у семисуточной культуры наблюдается обильный рост, цвет беловато-кремовый, поверхность мелкоскладчатая с мелко изрезанными краями и мягкой консистенцией.

При посеве на сусло-агар в чашки Петри семисуточная культура имеет овально-округлые колонии с матовой складчатой, морщинистой или кружевной поверхностью, цвет беловато-кремовый, профиль колонии выпуклый, край мелкофестончатый, мелкоизрезанный, консистенция мягкая, в диаметре 2,0-7,5 мм.

Гигантская колония (30-суточная) матовая округлой формы с кружевной и мелкоскладчатой поверхностью кремового цвета, выпуклой поверхностью и фестончатым, мелко изрезанным краем в диаметре 4-5 см.

При посеве штрихом на скошенном глюкозопептонном агаре с дрожжевым экстрактом и инкубировании в термостате при температуре 25^оС у семисуточной культуры наблюдается обильный рост, поверхность кремовато-желтая мелкоскладчатая с мелкоизрезанными краями, профиль слегка выпуклый, консистенция мягкая. Клетки круглые, значительно крупнее, чем на сусле-агаре, собраны в веточки (размеры 5,5-7,0 мкм).

При посеве штрихом на скошенном агаризированном предгидролизате (РВ 1,5-2,0% ) при термостатировании и температуре 25^оС наблюдается обильный рост, цвет светло-коричневый, поверхность кружевная с мелко изрезанными краями и мелкозернистой структурой, консистенция мягкая, профиль слегка выпуклый. Клетки овальной и овально-вытянутой формы, собраны в веточки и кустики (размеры 4,5-8,0 мкм). Клетки мельче, чем на сусле-агаре и длиннее, чем на глюкозопептонной среде.

При посеве на агаризированный предгидролизат в чашки Петри семисуточная культура образует округлые колонии светло-коричневого цвета, меньших размеров в диаметре (1,5-5,0 мм) с кружевной поверхностью, мелко изрезанными краями и мелкозернистой структурой.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм БК-85 является аэробом, образование псевдомицелия наблюдается на пластинах с картофельно-глюкозным агаром вне покровных стекол в аэробных условиях, под покровным стеклом (в анаэробных условиях) роста нет. При непрерывном культивировании в лабораторном ферментере с барботажной системой воздухораспределения расхода воздуха составляет 1,5 л/мин на 0,3 л культуральной жидкости.

Максимальная температура роста на твердых агаровых средах 38-40^оС, минимальная 18-25^оС, оптимальная 35-37^оС.

При культивировании на предгидролизате сульфат-целлюлозного производства развивается при температуре 35-40^оС, оптимальная температура 37-38^оС.

Штамм БК-85 осмотолерантен, наблюдается хороший рост на твердой среде с концентрацией глюкозы 50, 60 и 70% на жидкой среде рост только на 50%-ной глюкозе. Штамм обладает также высокой галотолерантностью, хороший рост наблюдается на жидкой среде с концентрацией NaCl от 1 до 20% на твердой среде от 1 до 9% NaCl.

Отношение к источникам углерода. Ферментация сахаров отсутствует. Культура хорошо ассимилирует глюкозу, галактозу, l-сорбозу, l-рамнозу, d-ксилозу, l-арабинозу, сахарозу, мальтозу, дульцит, d-маннит, d-сорбит, dl-молочную, янтарную, лимонную, уксусную, фумаровую и пировиноградную кислоты, а также инулин, мочевину, сернокислый аммоний, слабее лактозу, этанол, глицерин, инозит и нитраты, не усваивает растворимый крахмал, яблочную, салициловую кислоты и нитриты.

Процесс ферментации сахаров штамма Candida scottii БК-85 проводили в трубочках Дунбара при использовании среды: 0,5%-ный раствор дрожжевого экстракта и 2%-ный раствор всех сахаров, рафиноза 4%-ный раствор. Среды разливали в трубочки Дунбара и стерилизовали 30 мин при 0,5 кгс/см², а затем в каждую трубочку засевали по 1 мл приготовленной густой суспензии штамма БК-85, термостатировали и контролировали через 1,2,3 10 дней.

Ассимиляцию углеводов, спиртов и органических кислот осуществляли ауксанографическим методом с использованием следующей среды: (NH₄)₂SO₄0,5% KH₂PO₄ 0,1% MgSO₄ ˙7H₂O 0,05% к которой добавляли соответствующий сахар или спирт в концентрации 1% а органические кислоты в концентрации 0,2% дрожжевой автолизат 0,1% и промытый агар-агар 3% Контролем служила агаризированная среда без сахара. Посев штамма штрихом осуществляли в пробирки с приготовленными агаризированными средами. Способность дрожжей к усвоению того или иного соединения и интенсивность роста дрожжей определяли визуально через 15, затем 30 дней.

Отношение к источникам азота. Из источников азота штамм хорошо асиммилирует мочевину, пептон и сернокислый аммоний, слабее нитраты, не усваивает нитриты.

Исследования по ассимиляции азотсодержащих соединений нитратов, нитритов, сернокислого аммония, мочевины и пептона осуществляли при использовании среды с 0,5%-ным содержанием указанных азотсодержащих веществ, имеющих основу КН₂РО₄ 0,1% MgSO₄ 0,05% глюкозы 1% дрожжевого автолизата 0,1% промытого агар-агара 3% разлитых в пробирки и простерилизованных. Штамм засевали штрихом из густой водной суспензии клеток. Контролем служила среда без источника азота. Рост дрожжей оценивали визуально, сравнивая с контролем через 15 и 30 дней.

Штамм не расщепляет арбутин, не гидролизует мочевину, разжижает желатину, не образует органических кислот, не выделяет крахмалоподобных соединений, не нуждается в биотине.

Штамм способен расти на гидролизных средах в интервале рН 3,7-5,6, оптимальный рост при рН 4,3-4,5. При культивировании на предгидролизатах сульфатной варки целлюлозы не требуется внесения витаминов и других факторов роста, устойчив к вытеснению посторонней микрофлорой.

Штамм Candida scottii БК-85 не патогенен для животных и человека.

Отличительной особенностью штамма БК-85 по сравнению с другими штаммами вида Candida scottii является отсутствие явления гетероморфности, т.е. в неблагоприятных условиях ( повышенная концентрация фурфурола, повышение температуры и т.д.) крупные веточки и длинные нити штамма не распадаются на одиночные клетки.

На твердых агаровых средах образуются колонии R-формы (морщинистые, складчатые) и нет гладких колоний S-формы.

В лабораторных условиях на биостенде были проведены испытания штаммов Candida scottii БП-1 и Candida scottii БК-85.

Питательную среду готовят из предгидролизата сульфатной варки целлюлозы Байкальского ЦБК. Предгидролизат имеет следующий состав,
Глюкоза 1,86
РВ 5,10
Галактоза 0,35
Манноза 1,40
Ксилоза 0,51
Арабиноза 0,36
Уксусная кислота 0,30
Муравьиная кислота 0,10
Фурфурол 0,18
Бромируемые вещества 0,48
Перед выращиванием предгидролизат разбавляют водой до концентрации РВ 1,62% вносят питательные соли, содержащие азот, калий, фосфор в расчете на 60%-ный выход биомассы.

Условия выращивания: рН 4,3-4,5, температура 38-39^оС, дебит 0,25-0,35 ч^-1. Результаты представлены в таблице.

Как видно из представленных результатов, у известного штамма Candida scottii БП-1 выход и продуктивность значительно ниже, чем у штамма Candida scottii БК-85, при увеличении скорости роста выход биомассы у известного штамма падает до 35,1%
По содержанию сырого протеина показатели у штамма Candida scottii БК-85 на 6,4-7,2 абс. выше, чем у известного штамма БП-1.

Таким образом, приведенные результаты показали производственную ценность нового штамма дрожжей, характеризующегося активным биосинтезом белка и биомассы, высокой продуктивностью процесса.

Штамм дрожжей Candida scottii БК-85 имеет ряд преимуществ перед известными штаммами этого вида: выход биомассы с 1 м³ культуральной жидкости составляет 0,82 кг/м³ или 0,82 г/л при известном использовании ассоциации дрожжей, состоящей из Candida scottii Тул-6 и Candida scottii Кр-9, и максимальной скорости роста 0,26-0,28 ч^-1.

Съем биомассы штамма Candida scottii БК-85 составляет 8,96 г/л при максимальной удельной скорости роста 0,35 ч^-1, т.е. превышает съем биомассы известных штаммов в 10 раз.

При использовании штамма Candida scottii АБ-1 выход абсолютно сухих дрожжей от исходных РВ составляет 43-49% а содержание сырого протеина 52-53%
Выход абсолютно сухих дрожжей от исходного штамма Candida scottii БК-85 составляет 55-57% содержание сырого протеина 55-56%
Продуктивность штамма дрожжей Candida scottii БП-1 составляет 2,25 г/л˙ч при максимальной скорости роста 0,25 ч^-1 и содержании сырого протеина 52,7%
Продуктивность штамма Candida scottii БК-85 составляет 3,14 г/л ˙ч при максимальной скорости роста 0,35 ч^-1 и содержании сырого протеина 55,4%

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к переработке предгидролизатов сульфат-целлюлозного производства, и представляет собой новый штамм дрожжей, который может быть использован для получения кормового белка из жидких отходов, образующихся при производстве целлюлозы. Целью изобретения является получение нового штамма дрожжей, способного активно развиваться при повышенном содержании ингибиторов роста в субстрате, обладающего высокой скоростью роста (0,35 ч^-1), способного синтезировать белковую массу с содержанием сырого протеина 55 57% Новый штамм селекционирован в условиях непрерывного культивирования на предгидролизате с содержанием РВ 1,5% при высоком коэффициенте скорости разбавления среды. Авторы идентифицировали выделенный штамм как Candida scottii и присвоили ему N БК 85. Штамм депонирован в ВКМ за N ВКПМ У 546. Съем биомассы при коэффициенте скорости разбавления среды 0,35 ч^-1 составляет 8,96 г/л, выход абсолютно сухих дрожжей от исходных РВ составляет 55 57% содержащее сырого протеина 55 56% 1 табл.

Штамм дрожжей Candida scottii ВКПМ У-546 продуцент кормового белка.