Способ получения пептидов Советский патент 1989 года по МПК C07K14/61 A61K38/18 A61K38/27 

Изобретение относится к способу получения пептидов новых биологически активных соединений, которые могут Hi, 1ти применение в медицине.

Цель изобретения - разработка способа получения новых производных пептидов - малотокскчных, обладающих способностью вызывать секрецию природного GH, но более доступных соединений.

Пример 1. Синтез PGRF(l-44) свободной кислоты, имеющей формулу

см

H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Sei-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- Leu-Seг-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-. Лsp-lle-Met-Ser-Лrg-Gln-Gln-Gly- Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala- Arg-Ala-Arg-7 eu, осуществляется поэтапно с использованием пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы, которая поставляется из Lab, Systems Inc., с содержанием 0,9 Мэкв С1/г. GoeflH- нение BOG-Leu со смолой получа от согласно процедуре, описанной ниже, и это приводит в результате к заме- щению примерно 0,22 ммоль Leu на 1 г смолы. Все используемые растворители тщательно дегазируют путем пропускания инертного газа, предпочтительно гелия, с тем чтобы гарантировать от- сутствие кислорода, который может нежелательно окислять серу группы Met.

После снятия защиты и нейтрализации пептидную цепь поэтапно встраивают в смолу. Снятие защиты, нейтра- лизащш и введение каждой аминокисло обычно осуществляют согласно процедуре, описанной в табл. 1.

Для реакции соединения на 1 г смолы используют 1 ммоль BOG-защищенной аминокислоты в хлористом метилене плюс 1 экв. 0,5 М flGGl в хлористом - метилене или 30% ДМР в хлористом метилене, реакция протекает в течение 2 ч. При соединении с Arg используют смесь 10% ДМГ с хлористым метиленог:, используют как защитную группу с гид роксильной боковой цепью для Ser и ТЬГо 2-хлор-бензилоксикарбонил (2G1- Z) используют как защитную группу дл боковой цепи Lys. ToS используется д защиты гуанидиногруппы Arg, и Gin или Asp карбоксильная группа защищен как Bzl эф1ф. Гидроксильная фенольна группа Туг защищена как 2,6-дихлор- бензиле По окончании данного синтеза получают следующее соединение:

X,-Туг(Х)-Ala-Asp(Хз)-А1а-11е- Ihl-Thr(X)-ABn-Ser(X5)-Tyr(Xj)- Arg(Xg)-Lys(Х)-Val-Leu-Gly-Gln- Leu-Ser(Xj)-Ala-Arg(X6)-Lys(X)-

Leu-Leu-Gln-Asp(X,)-Ile-Met-Ser(X5)- Arg(Xg)-Gln-Gln-Gly-Glu(X,)-Ser(X5)- Asn-Gln-Glu(X,)-Arg(X6)-Gly-Ala- Arg(Xg)-Ala-Arg(Xg)-Leu-X,

где X, - бензилоксикарбонил;

X - 2,6-дихлорбензил;

X, - сложный бензиловый эфир;

Х - бензил;

о

5

5 О

0

5

0

5

Х - тозил;

Хб - 2C1-Z;

X - X-0-GHi-бензолполистирольный

смоляной носитель.

После того как последняя Туг группа соединена со смолой, BOG удаляют посредством 45% TFA в . Для того, чтобы отп1епить и снять 3auiji- ту с оставшейся защищенной пептидом смолы, ее обрабатывают 1,5 мл анизола, 0,25 МП метилэтилсульфида (MES) и 10 мл фтористого водорода (HF) на 1 г пептида - смолы при температуре -20 G в течение 30 мин и при 0°G также в течение 30 мин. После удаления HF в высоком вакууме оставшуюся смолу - пептид промывают поочередно обезвоженным диэтиловым эфиром и хлороформом, и пептид затем экстрагируют дегазированной 2 н. уксусной кислотой. В результате лиофилизации экстракта уксусной кислоты получают белое мягкое вещество, Отщепленньп и лишенный запц1ты пептид затем растворяют в 30%-ной уксусной кислоте и подвергают гель-фильтрации на тонком

геле Sephadex G-50, I

Данный пептид затем дополнительно очищают посредством катионообмен- ной хроматографии с использованием карбоксиметилцеллюлозы GM-32 Wliatman (18x18 см, УСЛОЯ ), и с использованием вогнутого наклона, образуемого путем закапывания 1 л 0,4 М , рН 6,5, в колбу для смешивания, содержащую 400 мл 0,01 М NIIjOAc, рН 4,5. Окончательную очистку осуществляют посредством распределительной хроматографии на носителе Phacmain тонкого порошка Sephadex G-50 с использованием системы растворителей EtOH: пиридин: 0,2%NHOAc 4:1:1:7о Хроматографичес- кие фракции тщательно разделяют методом тонкослойной (TLG) хроматографии с использованием 0,25 мм толщины предварительно покрытых стеклянных пластин, силикагеля 60 без флюоресцентного индикатора, проявление осуществляется с помощью системы растворителей: 1-бутанол, пирилин, уксусная кислота, вода 6:6:1,2:4,8. Пластины TLG око1гчательно проявляются посредством 2 г нингидрпна в 50 мт уксусной кислоты и 950 NUI 1-бутанола. Величина R составляет 0,46А. Собирают лишь те фракции, KtiTtipbie не показывают значительную степень иис.тоты.

5

Выход продукта 80 мг на каждый 1 г полистироловой смолы.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза в запаянных трубках уже известным в данной области методом с использованием аминокислотного анализатора Liguimat с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (3,62), Thr (0,75), Ser (3,5), Glx (6,83), Gly (2,87), Ala (5,10), Val (0,9), Met (1,23), He (1,84), Leu (5,045), Tyr (2,09), Phe (0,91), Lys (2,31), Arg (6,61), Анализ подтверждает правильную последовательность,

Определяют вращение плоскости поляризации света, и получают следующие результаты: ы, -65,6+1 (С 1,30%-ная уксусная кислота).

Пример 2. Осуществляют поэтапно синтез PGRF(1-40) формулы Н- Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln- Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala- OH,

используя пептидный синтезатор Бек- мана 990 на основе хлорметилирован- ной смолы. Синтез осуществляют аналогично примеру 1. Выход продукта со тавляет 37 мг на каждый 1 Г смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии (TLC) и жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLG) пептид абсолютно чист. Величина R,, измеренная аналогично примеру 1, составляет 0,414.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (3,89), Thr (0,88), Ser (3,66), Glx (7,04), Gly (3,07), Ala (4,02), Val (0,96), Met (1,01), He (1,86), Leu (4,28), Tyr (2,0), Phe (0,86), Lys (2,24) и Arg (4,15). Анализ подтверждает правильную последовательность. cCj .p -64,0+1

Пример 3. Осуществляют поэта но синтез PGRF(1-34) - свободной кислоты, имеющей формулу H-Tyr-Ala-Asp Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg Lys- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln- Gln-Gly-Glu-Ser-OH с использованием

318576

пептидного синтезатора Бекмлна 990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез проводят аналогично примеру 1. Выход продукта 121 мг на каждый 1 г смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения пептид, как показал анализ, пра0 ктически чистьй продукт. Величина R составляет 0,500.

Аминокислотный анализ осуществляю- ют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последователь5 ности, при этом получают следующие результаты: Agx (2,87), Thr (0,78), Ser (3,78), Glx (5,11), Gly (1,93), Ala (3,03), Val (0,88), Met (0,96), He (1,88) , Leu (4,14), Tyr (2,05), Phe .

0 (1,07), Lys (2,29) и Arg (3,22). Анализ подтверждает правильную последовательность . -60,8-t-l.

П p им e p 4a Осуществляют поэтапно синтез PGRF (1-31)-свободной кис5 лоты, имеющей формулу

H-Tyr--Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu- Seг-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-11е- Met-Ser-Arg-Gln-Gln-OH с использоваQ нием пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез проводят аналогично примеру 1. Выход продукта составлял 143 мг на каждый 1 г смолы, В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина R/ равна 0,536,

Аминокислотный анализ осутцествля- юг после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности. Анализ показывает следующие результаты: Agx (2,73), Thr (0,75), Ser (2,77), Glx (3,95), Gly (0,98), Ala (3,06), Val (0,80), Met (0,98), He (1,77), Leu (4,28), Tyr (2,23), Phe (1,14), Lys (2,34)

и Arg (3,22). Анализ подтверждает 0г 7

правильную последовательность. j,

-65,

П p и M e p 5. Осуществляют поэтапно синтез GRFO-44j-aмидa, имеющего следующую формулу: Н-Туг-А1а- Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-ArgLys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu- Gin-Asp-Ile-Met- Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Cl lias

5

Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NHi с использованием пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе 6 г смолы МВНА, с использованием тех же операций (изложенньк в виде табл. 1), что и в примере 1. Смолу- пептид обрабатывают 10%-ньгм анизоло в HF плюс MCS, как и в примере 1. После отделения смолы и ее промывки пептид экстрагируют уксусной кислотой и затем лиофилизируют. После очистки методом гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и затем распределительной хроматографии получают 321,4 мг пептида, выход которого составляет 54 мг на 1 г смолы. В результате обработки методом тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения данный пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина R, составляла .

Аминокислотный анализ осуществля- ют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, при этом получают следующие результаты: Agx (3,75), Thr (0,80), Ser (3,60), Glx (6,98), Gly (3,16)., Ala (5,04), Val (0,77), Met (1,02), He (1,79), Leu (5,41), Tyr (2,03), Phe (0,84), Lys (2,39) и Arg (6,43). Анализ подтверждает правильную последовательность. ut.3-p -63,1+1.,

П р и м е р 6. Осуществляют поэтано синтез PGRF(1-40 -амида, имеющего формулу H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe- Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu- Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-NH , используя пептидный синтезатор Бекмана 990 на основе МВНА смолы Синтез осуществляют аналогично примеру 3. Выход продукта 60 мг на каждый 1 г смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения получаемый пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина Rf составляет 0,464.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности получаемой последовательности, анализ показывает следующие результаты: Agx (3,76), Thr (0,8

5

0

5 Q 5

0

5

Ser (3,68), Glx (6,89), Gly (3,12), Ala (4,08), Val (0,88), Met (1,36), He (1,76), Leu (4,24), Tyr (2,00), Phe (0,80), Lys (2,32) и Arg (4,16). Анализ подтверждает правильную последовательность, oi- -62,.

Пример 7. Осуществляют поэтапно синтез GRFf1-37)-свободной кислоты, имеющей формулу Н-Туг-А1а- Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Glu-Leu-Ser- Al a-Arg-Lys-Le u-Leu-G In-Asp-He-He t- Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn- Gln-Glu-OH, с использованием пептидного синтезатора Бекмана 990 на основе хлорметилированной смолы. Синтез осуществляют аналогично примеру 1. Выход продукта 29 мг на каждый 1 г смолы. В результате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрещения получаемый пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина R.J составляет 0,421.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правильности пол% чаемой последовательности, анализ показывает следующие результаты: Agx (3,92), Thr (0,79), Ser (3,62), Glx (7,05), Gly (1,97), Ala (3,17), Val (1,03), Met (1,0), He (1,91), Leu (4,37), Tyr (1,86), Phe (0,76), Lys (2,15), и Arg (3,40). Анализ подтверждает правильную последовательность. Гос1 -61,7+1.

П р и м е р 8. Осуществляют поэтапно синтез GRF (1-37)-амида, имеющего формулу H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile- Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val- Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu- Leu-Gln-Asp-He-Met-Ser-Arg-Gln-Gln- Glu- Ser-Asn-cUn-G u-Glu-NH, используя пептидный синтезатор Бекмана 990 на основе МВНА смолы. Синтез осуществляют аналогично примеру 1. Выход продукта 25 мг на каждый 1 г смолы. В резз льтате обработки методами тонкослойной хроматографии и жидкостной хроматографии высокого разрешения получаемый пептид, как показал анализ, представляет собой практически чистый продукт. Величина RI составляет 0,507.

Аминокислотный анализ осуществляют после гидролиза с целью проверки правпльности получаог-юй послеповательности,анализ показывает следующие рзультаты: Agx (4,02) , Thr (0,80) , Ser

(3,49), Glx (6,90), Gly (1,92), Ala (3,08), Val (1,05), Met (1,01), He (1,77), Leu (4,05), Tyr (2,02), Phe (1,14), Lys (2,50) и Arg (3,27). Анализ подтверждает правильную последовательность, ol- -63,3jf1.

Проводят биологические испытания полученных пептидов,

Для определения эффективности пептида в ускорении вьщеления гормона роста проводят анализ в условиях ин витро с использованием синтетического GRF (1-40) из примера 2 в сопоставлении с равномолярными концентрациями экстрагированного и очищенного естественного GRF (1-40) ив сопоставлении с контрольным стандартом GRF, имеющим уже известную эффективность в ускорении вьщеления гомона из гипофизарных клеток. Контрольный стандарт представляет собой препарат, полученный от гипоталамуса крысы, который дает половину от максимальной реакции в отношении вьщеления GH при анализе многослойно биопр бы гипофизарной клетки.

Используют культуры, включающие клетки гипофизарных желез крысы, которые были предварительно удалены за 4-5 дней. Обе культуры определяемой стандартной среды и культуры, которые рассматриваются оптимальными для секреции гормона роста, используются для сравнительного испытания общепринятым образом. Инкубацию подвергаемого испытанию вещества осущест- вляют в течение 3-4 ч, аликвоты среды выращивания удаляют и подвергают обработке с целью определения их содержания в иммунореактивном (irGH) хорошо охарактеризованным методом радиоиммунопробы.

Биоактивность аналогов hpGRF in vitro (изучение клеток гипофиза крыс) относительные эффективности аналогов hp GRF-44-NH с исключенным окончанием - СООН даны в табл. 2.

Полученные результаты подтверждают низкую токсичность пептидов, синтезированных в условиях предлагаемого способа, и биологическую активность, выражающуюся в способности вызывать секрецию природного гормона роста.

.

ю

1520 2530

5 дО ДЗ

д

5

Формула изобретения

Способ получения пептидов общей формулы 1

A-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn- Ser-Tyr-Arg-Ile-Val-Leu-Gly-Gln- Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp- Ile-Met-R-x, где X - ОН, R-Ser-Arg-Gln-Gln; Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser; Ser-Asn-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn- Gln-Glu;

Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-Gly-Ala;

Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln- Glu-Arg-piy-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu, отличающийся тем, что, -защищенную аминокислоту общей формулы II

Boc-HN-G(R,Rj)COOH

где R,-H;

R -CHjrCH OH, -GHjGH(CH5)2 , -CH CH GGNHj, .СООН ,

присоединяют к полимерной смоле МБГА или бензилполистирольной, деблокируют и осуществляют постепенное наращивание пептидной последовательности в соответствии с общей формулой I и от полученного при этом пептидилпо- лимера общей формулы III (Х)-Ala-Asp(X,)-Ala-Ile-Phe- Thr(X)-Asn-Ser(X4)-Tyr(X)-Arg(Xf)- Lys(Xg)-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser(X4)- Ala-Arg(Xf)-Lys(Xg)-Leu-Leu-Gln- Asp(Xj)-Ile-Met-R-X, где X - 0- GHj- бензилполистирольная

смола; Ш - смола КБГД

Х( - бензилоксикарбонил; Xii-2,6 - дихлорбензкл; XJ, - сложный бензиловый эфир; Х - бензил; Ху - тозил; Х, - 2G1-Z;

R - имеет указанные значения,

отщепляют полимер-носитель и защитные группы.

Приоритет по признакам: 16.06о82 при R - Ser-Arg-Gln-Gln; Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser; Ser- Asn-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu. R - -Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn- Gln-Glu-Arg-Gly-Ala; 15.09.82 при R-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn- Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.

Таблица 1

Изобретение касается пептидов и, в частности получения соединений общей ф-лы I: H-TYR-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-LYS-LEU-GLN-ASP-ILE-MET-R-X, где X-OH или NH₂

R=а)-SER-ARG-GLN-GLN

б)-SER=ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-SER

в)-SER-ARG-GLN-GLN-GLU-SER-ASN -GLN-GLU

г)-SER-ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-SER-ASN-GLN-GLU-ARG-GLY-ALA

д)-SER-ARG-GLN-GLN-GLY-GLU-SER-ASN-GLN-GLU-ARG-GLY-ALA-ARG-ALA-ARG-LEU, которые способны вызывать секрецию природного гормона роста, что может быть использовано в медицине. Цель изобретения - создание новых малотоксичных и активных пептидов. Их синтез ведут присоединением к полимерной смоле МБГА или полистирольной смоле N-защищенной аминокислоты общей формулы BOC-HN-C(R₁ R₂)COOH, где R₁-H

R₂-CH₃, -CH₂OH,-CH₂CH(CH₃)₂, -CH₂CH₂CONH₂, -CH₂CH₂COOH. Затем продукт деблокируют и проводят постепенное наращивание пептидной последовательности в соответствии с формулой I. Далее отщепляют носитель и деблокируют полученный пептидилполимер общей формулы X₁TYR(X₂)-ALA-ASP(X₃)-ALA-ILE-PHE-THR(X₄)-ASN-SER(X₄)-TYR(X₂)-ARG(X₅)-LYS(X₆)-VAL-LEU-GLY-GLN-LEU-SER(X₄)-ALA-ARG(X₅)-LYS(X₆)-LEU-LEU-GLN-ASP(X₃)-ILE-MET-R-X, где X - O-CH₂-бензилполистирольная смола или NH-смола МБГА

X₁ - бензилоксикарбонил

X₂- 2,6-дихлорбензил

X₃ - сложный бензиловый эфир

X₄ - бензил

X₅ - тозил

X₆ - 2C1-Z

R -см.выше. Новые вещества оказывают влияние на секрецию гипофизарных желез, что может быть использовано для промотирования роста теплокровных и холоднокровных животных в сельском хозяйстве, а также в диагностической практике. 2 табл.

Этап

Реагенты -и операции

Промывка CHjClj (2 раза) 50% трифторуксусная кислота + 5% 1,2-этандитиол в 1-кратно) 50% трифторуксусная кислота (TFA)+ + 5% 1,2-этандитиол в (1-кратно)

Промывка CH,Cl2(3 раза) Промывка (2 раза) 10% триэтиламин () в СН,С12, нейтрализация (2 раза) Промывка (2 раза) 10% триэтиламин () с , нейтрализация (2 раза) Промьшка CHjOH (2 раза) Промывка (2 раза) ВОС -аминокислота (1 ммоль/г смолы) плюс эквивалентное количество ди- циклогексилкарбодиимида (ДСС) в CHjCl

Промывка CHjCl (1-кратно) 50% диметилформамид в (2- кратная промывка) Промывка 10% триэтнпамином (Et3N) в (1-кратно) npoNflbiBKa СИ ОН (2 раза) Промывка (2 раза) 25% уксусный ангидрид в (2 мл/ смолы) Промывка (2 раза) Промывка CHjOH (2 раза)

Для соединения Asn и Gin в данный этап введен 1,136 М избыток 1-оксибензотриазола (HOBt).

Таблица 2

Время смешивания , мин

0,5 0,5

20,0 0,5 0,5

0,5 0,5

0,5 0,5 0,5

120

0,5 0,5

0,5 0.5 0,5

20,0 0,5 0,5