Способ культивирования бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS Советский патент 1988 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

оо

00 4

to

О

о

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для накопления биомассы коклюшных бактерий в 1-й фазе. Цель изобретения - снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, а также стимулирование роста микроорганизмов. Суспензию бактерий Bordetella pertussis в 1-й фазе выращивают в плотной или жидкой питательной среде Штайнера-Шольте, дополнительно содержащей производные о/ -или /з -цикло- декстринов в концентрации I - 5000 мгк/мл среды. Посевы инкубируют при 30-38 0 в стационарных или погруженных аэробных условиях.При этом можно получить рост при посевной дозе 10 кл./мл.Для дополнительной стимуляции роста в состав среды вводят казаминокислоты в количестве 0,5-10 мг/мл среды. На плотной среде диаметр колоний составляет 1,0 - - 1,2 мм. 1 з.п. ф-лы, 3 табл. СО

сн

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть ис- пользовано для накопления биомассы коклюшных бактерий.

Цель изобретения - снижение посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, а также стимулирование роста микроорганизмов .

Способ осуществляют следующим образом.

Питательную среду Штайнера-Шоль- те (ШШ) готовят, -путем добавления дополнительного раствора, который получают стерилизацией с использованием миллипорового фильтра (0,45 мкм) из водного раствора, содержащего,г: 1-цистеин 4; сульфат двухвалентного железа I; аскорбиновая кислота 2; никотиновая кислота 0,4; глютатион восстановленного типа на 1 л раствора в концентрации 1 об.% к основной среде 10. Основную среду получают путем приготовления водного раствора, содержащего, г: глютамат натрия 10,7; 1-пролин 0,24; хлористый натрий 2,5; дигидрофосфат калия 0,5 хлористый калий 0,2; хлористый маг- . НИИ 0,1; хлористый кальций 0,02; три соксиметиламиномеЧ ан. на I л раствора 1,525, значение рН доводят до 7,6, затем стерилизуют в автоклаве при 121 С в течение 15 мин. В зависимости от концентрации микроорганизмов в среду вводят соответствующие количества циклодекстрина (ЦЦ) или его производной.

Для усиления роста микроорганизмов наиболее предпочтительным вариантом среды является питательная среда ШШ с 0,5-10 г/л казаминокислот.

Для выращивания; культуры можно использовать известные способы и условия. Однако выращивание при встряхивании является предпочтительным, и его желательно проводить при 30 - 38 С в течение 10-100 ч.

Bordetella pertussis 1-й фазы штамм Тохама выращивгиот при на среде ШШ, содержащей метил-р-цикло- декстрин, в течение 48 ч. Надосадоч- ную жидкость (рН 8,3), полученную центрифугированием культуральной жидкости, подают на колонку с оксиапа- титом, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером (рН 8,0). Раствор,выходящий из колонки, подкисляют до рН 6,0 и вновь подают на колонку с

оксиапатитом, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером (рН 6,0), и затем элюируют связанный белок 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCl, Полученный элюат подвергают аффинной хроматографии, используя гаптоглобин-сефарозу 4В, и затем злюируют целевой Продукт 0,1 М фос0 фатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCl и 3 М тиоцианата калия.

Нитевидный гемагглютинин получают посредством элюироэания связанного

5 белка в колонке с оксиапатитом (рН 8,о) 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCl, и очищают методом аффинной хроматографии на ran- тоглобулин-сефарозе 4Б.

0 Пример. Лиофилизированную культуру Bordetella pertussis штамм Тохама 1-и фазы суспендируют в 1%-ном растворе казаминокислоты и затем выращивают на среде Борде-Ген5 гона (ВГ), содержащей 20% лошадиной крови, из которой удален белок, при 35°С в течение 3 сут. Одну полную петлю с культурой растущих клеток стимулируют на среде БГ в тече0 ние 24 ч и суспендируют в среде ШШ. Получают суспензию концентрацией клеток 5-10 кл./мл.

Плотную среду ШШ с плотностью агара 1,2%, содержащую ДЦ или его. про5 изводнук, наносят на пластины, затем распьшяют микробную суспензию до содержания 10 клеток на одну пластину.

Результаты роста бактерий (число

0 колоний) после четырехсуточного инкубирования при 35°С представлены в табл.1.

Пример 2. Суспензию для ино- «кулирования, полученную по примеру

5 1,инокулируют в 1 мл жидкой среды ШШ, . содержащей метил-/1-ЦЦ при числе -клеток 10, и инкубируют при 35°С в L- пробирке Монода с возвратно-поступательным встряхиванием.

Результаты влияния концентрации метил-р-ЦЦ на мутность среды с культурой в зависимости от времени инкубации приведены в табл.2

г Из табл. 2 следует,- что при добавлении метил- -ЦЦ в среду в количестве от 1 до 500 мкг/мл степень помутнения среды возврастает пропорционально количеству ЦЦ, что свидетель0

ствует о промотировании роста микробов .

П р и м е р 3. Готовят плотную среду ШШ, при этом увеличивают концентрацию глютатиона восстановленного типа в 1,5 раза по сравнению с известной прописью I среды, и добавляют различные концентрации казаминокис- лот и метил- -ЦЦ. На каждую пластину со средой высевают 10 клеток Bordet eila pertussis 1-и фазы штамм Тохама и выращивают 3 дня при 35 С,

Результаты влияния казаминокис- лот и метил- -ЦЦ на рост бактерий Bordetella pertussis приведены в табл.3.

Из данных табл.3 следует, что в отсутствии добавок на среде 1Ш11 при посевной дозе 10 кл./мл рост отсутствует, в то время как при добавлении метил- -Ш1 в интервале 500 - 1000 мкг/мл количество колоний возрастает, а при добавлении казамино- кислоты в количестве от 500 до 5000 мкг/мл размер колоний увеличивается и их легко наблюдать (1,0- 1,2 мм по сравнению с 0,8 мм в контроле) .

П р и м е р 4. Жидкую среду ШШ усовершенствованного типа готовят путем добавления казаминокислоты в количестве 10 мг/мл. Увеличивают концентрацию глютатиона в 1,5 раза и в 20 раз концентрацию аскорбиновой кислоты и используют в количестве 1 об.% от основной среды. Метил-/5-ЦД добавляют в соответствующие пробы среды в количествах от 50 до 5000 мкг/мл. Приготовление пробы сред разливают по 200 мл в колбы Са- кагучи. Каждую порцию среды инокули- руют суспензией бактерий при концентрации клеток 1,5-10 кл./мл и инкубируют.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что добавление произ 10 10

10-100 100-500 10-100 10-100

водного ЦЦ в культуральную среду в количестве от 50 до 2000 мкг/мл в присутствии казаминокислоты усили-

вает рост клеток Bordetella pertussis .

Использование циклодекстринов позволяет повысить ростовые свойства среды, что в свою очередь позволяет

снизить посевную дозу инокулята,стабилизировать процесс культивирования, а добавление казамииокислот - получать более пышный рост бактерий.

Формула изобретения

ра-Шольте, содержащей источники углерода, азота, набор минеральных солей, аминокислот и витаминов, в стационарных или погруженных аэробных условиях при 30-38°С, отличающ и и с я тем, что, с целью снижения посевной дозы микроорганизмов за счет повышения ростовых свойств среды, культивирование осуществляют в присутствии гексакис-(2,6-о-диметил)-о/-циклодекстрина или гептакис- (2,6-о-диметил)- -циклодекстрина в концентрации 1 - 5000 мкг/мл питательной среды.

10 мг/кл среды казаминокислот при

концентрации гексакис-(2,6- о-диме- тил)-с/-циклодекстрина или гексакис- (2,6-о-диметил )-/5-циклодекстрина 250-1000 мкг/мл среды, а в жидкий вариант среды казаминокислоты добавляют в концентрации 5-20 мг/мл среды при концентрации циклодекстрина 50 - 2000 мкг/мл среды. IТ а б л и ц а 1

10-100 100-500 10

500-1000 100-500 10

100-500 100-500 10

Метил- -ЦЦ Этил-/ г-1Щ

гвд

Метил-} -ЦЦ

10 10 100-500 500-1000 500-1000 100-50010-100

10 10 10-100 10-100 100-500 100-50010-100

10 10 ОО 10 10-100 10-100100-500

Q МО 10 10-100 100-500100-500

Примечание. «/-метилциклодекстрии-о -ЦЦ; гексакис-(2,6-о-диметил)-(циклодекстрин - метил- /-ЦД , гептакис-(2,6-о-диметил)-/з- циклодекстрин - метил-/ -ЦД.

Т а б л.и ц а 2

Концентрация

Степень помутнения среды (ОП 650 ммк)

через, ч

О 1

5

10

50

100

500

00

0,005 0,010 0,01 1 0,015 0,015 0,015 0,016 0,007

Продолжение табл.1

через, ч

0,280 0,340 0,330 0,370 0,430 0,430 0,540 0,300

0,490 0,540 0,540 0,500 0,675 0,695 0,747 0,485

Таблица 3

Колонии относительно малого размера,

iПродолжение табл.3