Способ получения фракции НА, содержащей защитный антиген ВоRDетеLLа реRтUSSIS Советский патент 1988 года по МПК A61K39/10 

:&

Ч ГО

О) Од

Изобретение относится к медицинской промьйшенности и может быть использовано при получении коклюшной вакцины. Цель изобретения - интенсификация способа. Для получения -- фракции НА Bordetella pertu ssis культуру в одной фазе выращивают в .жидкой питательной среде известного состава, в которую дополнительно вводят метилированный или /з-циклодекстрин в концентрации 1-10 г/л. При необходимости для стимуляции роста в среду вводят 0,1-20 г/л казаминокислот, 0,01-1 г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л глютатиона. Процесс культивирования ведут при 20-31°С в условиях аэрации и перемешивания, обеспечивающих концентрацию кислорода 1,0-5,5 ррт и пеногашение. Отбор культуральной жидкости для выделения целевого продукта осуществляют на стадии от -логарифмической фазы роста до статической, 4 табл. О)

ы

Изобретение относится к медицинсой промьппленности и может быть исользовано при получении коклюшной вакцины.g

Цель изобретения - интенсификация способа.

Пример 1. В ферментер объемом 50 л загружают 35 л модифицированной питательной среды, to содержащей глутамат натрия

10,72 г/л, 1-пролин 0,240 г/л, фосфат калия 0,5 г/л, хлорид калия 0,2 г/л, хлорид магния 0,1 г/л, хлорид кальция 0,02 г/л, трисгидро- IS ксиметиламинометан 6,1 г/л, казами- нокислоты 10,0 г/л, рН 7,3 (основная среда). Стерилизуют при 121®С в течение 30 мин.

Отдельно готовят дополнительную идкость, содержащую 1-цистеин гидрохлорид 0,04 г/л, сульфат железа 0,01 г/л, аскорбиновую кислоту , / 0,4 г/л, ниацин 0,004 г/л, глюта- jc тион (восстановленный тип) 0,15 г/л. Эту среду стерилизуют с помощью мембранной фильтрации. Основную и дополнительную среды смешивают перед использованием. Стерильньй метили- рованньш /i-циклодекстрин добавляют в конечной концентрации 1,0 г/л.

После инокулирования В.pertussis 1 фазы в количестве 1-10 микр.тел среду культивируют при аэрации через дно реактора с помощью барботера с 35 механическим обеспечиванием при 35°С, рН 7,2, в течение 24 ч при различном количестве растворенного кислорода (до).

Повышенный рост микроорганизмов и интенсивное продуцирование фракции НА наблюдается в диапазоне до 0,7-6,0 ррт, особенно при 1,0-5,5ррт.

К культуральной жидкости или к жидкой фазе культуральной жидкости добавляют сульфат аммония до степени 1/3 насьпцения. Осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием. Осадок растворяют в фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 1 моль NaCl. К раствору добавляют сульфат аммония до степени 1/2 насыщения, осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием, диализуют против фосфатного буфера. Полученньй раствор ультра- центрифугируют, верхний слой жидкости центрифугируют в градиенте плотности сахарозы и отделяют верх30

40

45

50

c

5

0

0

5

0

НИИ слой жидкости (фракции НА В.pertussis). Вьц еление осуществляют предпочтительно при и ниже. Полученная фракция НА содержит большое количество LPF-HA и F-HA.

Фракцию НА разбавляют солевым раствором до 2-3-кратного разбавления и добавляют формалин в концентрации от 0,1 до 1,2 об.%. Смесь обрабатывают при 20-43 С в течение 3-60 дней., LPF активность и активность HSF (гис- тамин-чувствительный фактор) уменьшаются и получают нетоксичную фрак- .

В сравнительньк примерах 1-10 и примерах 2-5 проводят сравнение по- .лучения фракции НА В.pertussis; в различных условиях культивирования (при постоянной аэрации и скорости перемешивания и при переменной аэрации и перемешивании).

В ферментер емкостью 14 л загружс- ют 10 л среды (по примеру 1) и иноку лируют культуру в количестве 1 «10® микр.тел/мл. Культивируют при аэрации и перемешивании при в течение 36 ч.

Влияние условий аэрации и перемешивания на интенсивность роста куль- туры В.pertussis 1 фазы и выход целевого продукта представлены в табл.1,

В сравнительных примерах 1-5,7 и 8 культивирование осуществляют при постоянных аэрации и перемешивании без пеногашения и в этом ряду примеров условия культивирования в сравнительном примере 5 (скорость перемешивания 100 об/мин, аэрация - 0,5 УУМ) приводят к хорошему продуцированию фракции НА. Однако скорость роста быстро уменьшается и после 36 ч культивирования концентрация клеток не превышает 15-109 микр.тел/мл.

В сравнительных примерах 7 и 8 культивирование, осуществляют при постоянной скорости перемешивания 500 или 600 об/мин при скорости аэра- ции 0,2 WM без пеногашения. После 5-10 ч выращивания клетки либо прилипают к верхней стенке реактора, либо культура выбрасывается из реактора за счет сильного пенообразова- ния, продуцирование НА-фракции низкое .

В сравнительном примере 10 культивирование осуществляют при контро

лировании ДО, но без пеногашения. В этом случае также продуцирование НА-фракции очень низкое из-за адгезии клеток и их выброса с пеной.

В сравнительных примерах 6-9 культивирование осуществляют при постоянной скорости аэрации и перемешивании с пеногашением. Во всех случаях, в которых количество ДО на начальной стадии культивирования больше 6,0 рр условия, пригодные для продуцирования фракции НА, не обеспечивались. С интенсификацией роста культура ДО уменьшается и через 36 ч его уровень снижается до 0,7 ррт, что неблагоприятно влияет на размножение клеток и продуцирование фракции НА.

Б сравнительном примере 9, где осуществляют пеногашение с помощью химических веществ, через 36 ч концентрация клеток достигает О 80 -10 микр.тел/мл, но количества F-Ha и LPF-HA составляет 128 НА/мл и 500 LPE ед./мл соответственно,

В примерах 2-5 культивирование осуществляют при контролировании ДО в диапазоне 1,6-3,5 ррт с помощью автоматического и непрерывного контроля аэрации и скорости перемешивания до-контролером. После Ю ч микроорганизмы росли в логарифмической фазе и после 36 ч получены высокие урожаи клеток F-HA и LPF-HA.

Осуществление азрации с поверхности препятствует продуцированию фракции НА,

В сравнительном примере 11 и примерах 6 и 7 проводят сравнительное культивирование по предлагаемому способу и в стандартных статических условиях. Количество инокулята 1 10 микр.тел/мл, температура 35 С,

Статическое культивирование (сравнительный пример 11). Реактор для культивирования 1,5 л; колба КОИХ; среда - модифицированная (пример 1) в количестве 0,2 л, время инкубирования 120 ч.

Культивирование под контролем (примеры 6 и 7 по изобретению). Реактор для культивирования: ферментер емкостью 300 л, среда - модифицированная (пример 1) 200 л, дополнительно содержащая 1 г/л метилированного |1-циклодекстрина (пример 6) и 1,0 г/ метилированного р-циклодекстрина (пример 7). до-контроль 2,2-2,4 ррт. Пеногашение механическое с помощью

15

ю

7266

вращающегося диска. рН-контроль: рН 7,3 время инкубирования 35 ч.

Сравнительные данные по культивированию в различных условиях приведены в табл.2

Из табл.2 следует, что способ по.изобретению в 2-3 раза эффективнее статического культивирования по концентрации клеток, в 10 и более раз - по уровню с/ PF-HA, время инкубации сокращается до 35 ч.

Пример 8. Фракцию НА, полученную в примере 1, разбавляют физиологическим раствором до уровня концентрации протеина 30 мкг TCAPN/мл. К раствору добавляют формалин в концентрации 0,6 или 1,0 об.% и смесь обрабатывают при 37

или 39 С в течение 5-21 дня, на стадии обработки формалином добавляют аминокислоты (глицин, лизин, серин, метионин, цистеин, глютамат натрия или аспарагиновая кислота в концентрации 0,25 М или смесь глицири- на и серина в концентрации 0,15 М).

В течение обработки формалином аггрегируется осадок, а раствор ди- ализуют для удаления формалина. Целевой- продукт контролируют на остаточную токсичность на мышах, а.после трехнедельного хранения при 37°С - на обратимую токсичность.

Пример 9. Штамм Tohama фазы 1 В.pertussis культивируют в среде Bordet-gen-gengon, получают посевную культуру и используют ее для инокулирования 0,4л модифицированной среды (пример 1), которая дополнительно содержит 10 мг/мл метилированного |Э-циклодекстрина, в двухлитровой колбе при конечной концентрации 10 микр.тел/мл.

Инкубацию осуществляют при вращательном встряхивании при 200 об/мин и при в течение 18 ч для получения посевной культуры.

Полученные культуры объединяют и инокулируют в такую же среду, как

было описано, Б ферментер емкостью 300 л в количестве 1-10 микр.тел/млj культивируют в условиях аэрации и перемешивания.

Культивирование осуществляют ри автоматическом контроле аэрации

и скорости перемешивания, поддерживая ДО в диапазоне 1,8-2,7 ррт. Температуру поддерживают на уровне 35°С, рН 7,2. Пепогашение осуществл«ют механически с помощью ротационного диска.

Через 35 ч культивирования отбирают пробу культуральной жидкости и измеряют концентрацию клеток (210-Ю ьшкр.тел/ип), F-HA (1024 НЛ/мл) и LPr-HA (2400 LPE ед/мл Культуральную жидкость центрифугируют и отделяют супернатант, К нему добавляют сульфат аммония до степени насыщения 1/3, образующийся осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/ми1 в течгние 30 мин. Осадок растворяют в буферном растворе (рИ 7,2), содержащем дополнительно 1 моль NaCl, и отделяют нерастворек- ные вещества центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин, К полученному верхнему слою жидкости добавляют сульфат аммония до степени насыщения 1/2, Получающиеся осадки отделяют центрифугированием по описанной методике и повторно растворяют в буферном растворе, диализуют при 4°С и нерастворенные вещества отделяют центрифугированием и отбрасывают. Раствор усиленно центрифугируют, супернатант центрифугируют в градиенте плотности, сахарозы 10-30% (39000 об/мин в течение 20 мин) и затем отделяют фракции НА. Полученные фракции НА объединяют и стерилизуют фильтрованием через мем- бранньт фильтр. Раствор, содержащий ИА-фракцию, разбавляют буферным раствором до концентрации протеина 300 мкг ТСАР/мл. Все стадии обработ- . ки культуральной ЖРЩКОСТИ и очистки целевого продукта осуществляют при

2-4°С. t

К полученной НА фракции добавляют 0,6 об,% формалина, 0,05 об.% твина-80, 0,02 вес./об,% желатины и 0,25 М глицина и хранят смесь в течение 7 дней при 39°Ct Смесь после хранения диализуют против фосфатного буфера рН 7,2, дополнительно содержащего 0,7 вес,/об.% NaClj и полу- (шнный раствор разбавляют тем же буферным раствором до концентрации протеина 8 мкг ТСАР/мл. К разбавленной нетоксичной НА-фракции добавляют гел гидроокиси алюминия в количестве

5

0

5

0

5

0

5

0

fe

0,2 мг/мл (в расчете на алюминий), при этом НА-фракция адсорбируется на геле, к которому добавляют 0,01 вес./об.% тимерсола. Получают очищенную убитую адсорбированную коклюшную вакцину.

Результаты проверки вакцины представлены в табл.3.

Пример 10. К разбавленному раствору нетоксичной фракции НА (пример 9) добавляют дифтерийньш ток- соид (33 Lf/кл) и CTojiонячный ток- соид (5 Lf/мл), к смесз- добавля от гель гидроокиси алюминия (0,2мг/мл в расчете на алюминий) для получения адсорбированной тривакцины К смеси добавляют 0,02 вес./об,% желатины и 0,1 вес./об.% глюкозы для стабилизации препарата, а также 0,01 вес./об., тимерсала в качестве фиксатора.

Свойства полученной тривакцины представлены в табл.4,

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет интенсифицировать процесс получения коклюшного антигена, используемого для приготовления моно- и тривакцины (АКДС-вакцины).

Формула изобретения

Способ получения фракции НА,, содержащей защитный антиген Bordetella pertussis, включающий культивирование штамма Bordetella pertussis; в 1 фазе в жидкой среде в присутствии 1-10 г/л метилированного. о(-цикло- декстрина или метилированного /1 -цик- лодекстрина и при необходимости 0,1- 20 г/л казаминокислот, г/л аскорбиновой кислоты и 0,1-5 г/л глютатиона в условиях перемешивания при 20-37 С и отбор полученной НА фракции из культуральной среды на стадии от логарифмической фазы роста до статической фазы роста, отличающийся тем, что, с целью интенсификации способа, культивирование проводят в присутствии растворенного кислорода в количестве 1,0- 5,5 ррга в условиях, обеспечивающих исключение пенообразование.

При контролировании (+), без контролирования (-).

С химическим обеспенивающим агентом (+), механическое сбеспенивание (-) Авт означает, что аэра1даю и перемешивание изменяют автоматически для контроля DO.

Таблица 1

НетДаДа

) 85 210 210

1024 1024 1024

1ЬО 2350 1600

120 35 35

Таблица 3

Содержание азота протеи мкг/мл

Тест на стерильность

Тест на устойчивость

Концентрация ионов водорода

Тест на независимость

от термолабильного

токсина

Тест на токсичность

(по уменьшению живоговеса мьши), BWD ед/мл

Таблица 2

Тест на токсичность (по возрастанию лейкоцитов мьшш) , LP ед/мл Тест на токсичность (по чувствительности к гистамину мыши), HS ед/мл

Пирогенный тест (общая температура )

Содержание алюминия,

мкг/мл

Содержание тимерсала,

вес,/об,%

Содержание формаЛь- дегида, вес./об,%

Тест на независимость от аномальной токсичности:.

на мыши

на гвинейской свинье

Тест на эффективность IP ед/мл

Содержание азота протеина, мкг/мл

Тест на стерильность Тест на устойчивость

Концентрация ионов водорода

Тест на независимость от термолабильного токсина

Тест на токсичность (по уменьшению

Прошел

0,82

(0,42-1,25) Прошел

0,06 (0,01-0,16)

Прошел, 0,4

0,168 0,009

0,002

Прошел

Прошел, 13,5

Таблица 4

28,0

Стерильно Прошел

6,72

Прошел

Прошел 9.3

живого веса мьшш), BWD ед/мл

Тест на токсичность (по увеличению лейкоцитов мьппи) , LP ед/мл

Тест на токсичность (по чувствительност к гистамину мьшш) HS ед/мл

Пирогенный тест (общая температура )

Содержание алюминия, мкг/мл

Содержание тимар- сала, вес./об.%

Содержание формальдегида, .вес,/об.%

Тест на независимость от аномальной токсичности:

на мьшш

на гвинейской свинье

Тест на стерильност на кролике

на гвинейской свинье

(4,2-17,0)

Прошел 0,66 (0,33-1,02)

Прошел 0,04 (0,01-0,12)

Прошел, 0,5

0,174 . 0,0094 0,002

Прошел