СПОСОБ ЭЛЕКТРОИММОБИЛИЗАЦИИ АНТИТЕЛ Российский патент 2018 года по МПК C07K17/14 C12N15/13 G01N27/00 

Изобретение относится к прикладной биохимии и иммунологии, и может быть использовано при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов и сенсоров на основе кварцевых резонаторов.

Известен способ иммобилизации белковых молекул за счет использования в качестве активирующего агента триэтоксисилана (3, 3-диэтоксипропил, ДЭПТЭС) в количестве, не превышающем трехкратный молярный избыток по отношению к количеству гидроксильных групп, имеющихся на поверхности носителя. Основным недостатком этого способа является многоэтапность и длительность проведения манипуляций с использованием значительных количеств ингредиентов, разноплановых вспомогательных средств и специального оборудования [А.с. СССР №681837. Опубл. в Бюл. №47, 23.12.1980].

Известна методика предварительной активации в плазме полиэтиленимина функциональной неорганической поверхности кварцевого резонатора для покрытия последней реакционно-функциональными группами и последующей иммобилизации сенсорных молекул - антител для детекции гомологичных антигенов инфекций, представляющих потенциальную угрозу популяции человека и животным, как диким, так и живущим под мониторингом людей.

Несмотря на высокую эффективность образования реакционно-функциональных групп на поверхности резонатора за счет энергии УВЧ-поля в вакууме последующая ковалентная иммобилизация специфических сенсорных молекул проводилась со значительным перерасходом иммуноглобулинов, а также без дополнительного энергетического воздействия на процесс фиксации белковых молекул на неорганической поверхности [Пат. РФ №2510830. Опубл. в Бюл. №10, 10.04.2014].

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ электроиммобилизация С-пептида проинсулина на чипе кварцевого сенсора для аффинной очистки белка [Melles Е., Anderson Н., Wallinder D., Shafqat J., Bergman Т., Aastrup Т., Jornvall H. Electroimmobilization of C-peptide to a quartz crystal microbalance sensor chip for protein affinity purification // Analitical Biochemistry / - 2005, Vol. 341. - P. 89-93]. В этой работе авторы модифицировали пъезокварцевый биосенсор Attana 80 (фирма «Attana», Stockholm, Sweden) таким образом, чтобы прикладываемый потенциал электрического поля распространялся на функциональную поверхность кварца и жидкостный поток исследуемого аналита за счет дополнительного электрода. При этом предусмотрена возможность вариации потенциала поля от «-» 8 до «+» 8 В/см относительно поверхности кварца при расстоянии между электродами 10 мм, т.е. амплитуда напряженности поля и его направленность могли быть изменены в широких пределах. В то же время эффективность иммобилизации лигандов, как показали авторы в материалах работы на графиках изменения частотной характеристики кварца, при дополнительном воздействии электрическим полем стабильно воспроизводима и подтверждается кратной возможностью иммобилизации и элюции лигандов.

Основным недостатком предложенной авторами методики является отсутствие указаний на удельные электрометрические параметры прикладываемого поля к электродам модифицированной модели биосенсора Attana 80. Также следует отметить сложность и длительность выполнения отдельных этапов и манипуляций при иммобилизации аминокислотных фрагментов с использованием энергии электрического поля для выделения очищенных белковых молекул.

Целью изобретения является упрощение способа, сокращение расхода белкового раствора и сроков получения иммобилизованных белковых молекул на электропроводных поверхностях кварцевого генератора и/или частицах носителя - стандартного образца магнитного сорбента (СО МС) за счет приложения энергии постоянного и/или пульсирующего электрического поля в однородном магнитном поле.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови основано на способности их фракций приобретать разновеликие заряды в растворе и перемещаться с отличающимися скоростями в поле постоянного электрического тока за счет возникающих сил явления электромагнитной индукции.

Выделению белков из биологического материала и белково-липидных комплексов биомембран способствует обработка их детергентами - додецил сульфат натрия и др. Отличия аминокислотных составов белковых фракций сыворотки крови при рН 8,6 приводят к отличиям величины заряда, но сохраняется один знак заряда - «отрицательный». При этом глобулины растворимы только в слабосолевых растворах и являются амфотерными полиэлектролитами. В поле постоянного электрического тока в щелочной среде (рН>7,0) белки перемещаются к аноду (плюс), в кислой среде (рН<7) белки перемещаются к катоду (минус) [http;//www.studfiles.ru/preview/3579524/page:3/].

Кроме того, для повышения эффективности разделения по молекулярным массам фракций белков известна методика повторно-кратковременного воздействия на перемещаемые пулы молекул за счет приложения дополнительных совпадающих по направленности импульсов постоянного электрического поля, способствующих повышению эффективности и увеличению скорости процесса, т.е. приводят к сокращению времени.

Сущность технического решения способа заключается в экспериментальном обосновании физико-химических и иммунобиологических параметров ингредиентов для сокращения времени, экономии растворов антител и повышения эффективности их иммобилизации на электропроводных поверхностях за счет приложения к электродам вертикальной микроэлектрофоретической камеры, заполненной гранулами silica gel 40, находящейся в однородном магнитном поле, и энергии постоянного электрического поля, а также дополнительных совпадающих по направленности импульсов постоянного электрического поля при нанесении сенсорного покрытия на электроды и/или размещении обрабатываемых объектов в виде частиц стандартного образца магнитного сорбента на электродах.

Для отработки опытным путем параметров электроиммобилизации антител в буферном растворе авторами была сконструирована разборная вертикальная микроэлектрофоретическая камера в виде колонки цилиндрической формы высотой 0,3; 2,0 и 7,0 мм. В зависимости от высоты колонок и прикладываемых импульсов электрического поля его напряженность составила от 3,7 до 120 В/см. При этом были учтены известные магнитные и электрометрические параметры длительности, напряженности и плотности тока на единицу поверхности поперечного сечения обрабатываемого образца, а также магнитные параметры однородного магнитного поля, образуемого ниобиевыми магнитами с напряженностью, составившей 250,0 тТ. За счет этого поля удерживаются частицы частиц стандартного образца магнитного сорбента на поверхности электродов, а наличие гранул silica gel 40 и ограничивает проявления тепловой и электроиндуцированной конверсии. Величина тока из расчета на единицу поперечного сечения микрокамеры составляет 600 μА/см². Удельная энергия электрического поля, прикладываемого к одной единице площади поперечного сечения микроэлектрофоретической камеры, в среднем составляет 2,9 Вт/см². При этом энергия, прикладываемая к единице объема этой камеры, без учета энергии кратковременных импульсов, соответственно, составляет от 0,13 до 1,92 Вт/см³.

Возможность практического использования заявляемого способа электроиммобилизации антител на электропроводной поверхности подтверждена примерами конкретной электроиммуноиммобилизацией бруцеллезных и туляремийных антител на функциональных золотых электродах кварцевых пластин и/или на частицах стандартного образца магнитного сорбента.

Пример 1. Электроиммобилизацию специфических бруцеллезных антител в буферном растворе проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 2,0 мм в однородном магнитном поле с основанием в виде постоянного ниобиевого магнита диаметром 15 и высотой 2,0 мм. За счет магнитного поля последний фиксировался к стальной пластине, а резиновая геметизирующая прокладка вокруг него во время работы системы прижималась замкнутым магнитным полем, образуемым с магнитом верхнего электрода. Один из кварцевых резонаторов ДМ-7 диаметром 14 мм с золотыми электродами, выведенными на одну его сторону, помещали электродами вниз на магните, а на открытую функциональную поверхность устанавливали диэлектрическую цилиндрическую муфту диаметром 15 с внутренним каналом диаметром 10,5 и высотой 2 мм. Объем камеры аккуратно заполняли гранулами silica gel 40, из расчета его последующего изменения объема, при внесении активирующего биоспецифического буферного раствора антител к бруцеллезной сыворотке. Раствор антител готовили на основе исходного концентрированного × 10-ного трис-ацетатного буферного раствора (ТАБ) с концентрацией додецилсульфата натрия 0,5% путем внесения во флакон 4-х частей дистиллированной воды, 2-х частей ТАБ, 1-й части бруцеллезной сыворотки с концентрацией антител 1,0 мг/мл. Объем камеры полностью заполняли приготовленным буферным раствором антител. К увлажненной поверхности силикагеля сверху функциональным электродом, обращенным вниз, прикладывали кварцевый резонатор, которым выравнивали сыпучий наполнитель. Поверх кварцевой пластины устанавливали контакт токовода в виде токопроводящего немагнитного (бронзового) цилиндра диаметром 16 мм с установленным в его нижней части ниобиевым магнитом диаметром 10 и толщиной 1,0 мм, обеспечивавшим герметичность и фиксацию контактов приложения электрического поля с напряженностью 12,5 В/см в течение 2-х мин. Напряженность, ток, сопротивление и проводимость системы контролировали мультиметром. При этом удельная мощность электрического поля, прикладываемого к одной единице площади поперечного сечения микрокамеры, в среднем составила 2,9 Вт/см², а энергия, прикладываемая к единице объема микрокамеры, без учета энергии кратковременных импульсов, составила от 0,142 Вт/см³. Кварцевые электроды, использованные в качестве анода (плюс) и катода (минус), извлекали из микрокамеры, промывали в 10-кратно разведенном физиологическом растворе, высушивали, сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 1453±3,74 и 1820±2,23 Гц. В потоке суспензии клеток бруцелл с концентрацией 10⁴ м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330 (ЗАО «ЭТНА», Москва), отмечали снижение частот резонаторов анодного и катодного соответственно на 467±2,45 и 615±4,61 Гц.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител к туляремийному микробу. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 724,38±0,14 и 724,46±0,24 Гц. В потоке суспензии клеток туляремии с концентрацией 10⁴ м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330, отмечали снижение частот резонаторов анодного и катодного соответственно на 724,39±0,14 и 1188,15 Гц.

Пример 3. Отличается от примера 1 тем, что к электродам постоянного электрического тока дополнительно прикладывали 30 импульсов постоянного тока общей длительностью 3,0 сек с напряженностью 36 В/см. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 1188,15±12,03 и 1179,46±15,35 Гц. В потоке суспензии клеток бруцелл с концентрацией 10⁴ м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку, отмечали снижение частот резонаторов анодного и катодного соответственно на 693,42±11,43 и 584,25±6,52 Гц.

Пример 4. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител к туляремийному микробу, а к электродам постоянного электрического тока дополнительно прикладывали 10 импульсов постоянного тока общей длительностью 3,0 сек с напряженностью 36 В/см. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 543,27±9,19 и 678,62±11,26 Гц. В потоке суспензии клеток туляремии с концентрацией 10⁴ м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330, отмечали снижение частот резонаторов соответственно на 374,00±8,39 и 375,08±8,46 Гц.

Пример 5. Отличается от примера 1 тем, что электроиммобилизацию специфических бруцеллезных антител в буферном растворе проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 0,3 мм при напряженности электрического поля 83 В/см в течение 1,0 мин. Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно составил 430±15,51 и 1390±10,59 Гц. В потоке суспензии клеток бруцелл с концентрацией 10⁴ м.к./мл, принудительно проходящем через жидкостную ячейку с помощью векторного анализатора цепей CPNA-330, отмечали снижение частот резонаторов соответственно на 2355±14,48 и 2835±11,76 Гц.

Пример 6. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител к туляремийному микробу, а электроиммобилизацию проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 0,3 мм при напряженности электрического поля 83 В/см в течение 1,0 мин.

Сдвиг частот на анодном и катодном кварцевых резонаторах соответственно,составил, 497,83±5,92 и 541,64±10,21 Гц, затем в потоке суспензии клеток бруцелл концентрацией 10⁴ м.к./мл отмечали снижение частот резонаторов соответственно на 378,09±7,27 и 425,86±5,71 Гц.

Пример 7. Отличается от примера 1 тем, что электроиммобилизацию специфических антител в их буферном растворе проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретической камере высотой 7,0 мм при напряженности электрического поля 4,2 В/см и удельной плотности энергии на единицу объема 0,142 Вт/см³ в течение 4-х мин. При этом предварительно на золотые электроды в виде кварцевых пластин ДМ-7 нанесли по 25 мг частиц стандартного образца магнитного сорбента, удерживаемого в однородном магнитном поле ниобиевыми магнитами. Магносорбенты многократно промывали раствором ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре. После многократной отмывки магнитного сорбента в растворе ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре и приведения их к концентрации 1:10 в растворе ФСБ по традиционной методике выполняли ИФА, показавшему пороговую чувствительность 10³ м.к./мл, с более чем двукратным увеличением оптической плотности в опыте по сравнению с контролем.

Пример 8. Отличается от примера 1 тем, что в качестве активирующего биоспецифического раствора использовали буферный раствор антител туляремийного микроба, а их электроиммобилизацию проводили в вертикальной разборной микроэлектрофоретическо камере высотой 7,0 мм при напряженности электрического поля 4,2 В/см в течение 4-х мин. При этом предварительно на золотые электроды в виде кварцевых пластин ДМ-7 нанесли по 25 мг частиц стандартного образца магнитного сорбента, удерживаемого в однородном магнитном поле ниобиевыми магнитами. Магносорбенты многократно промывали раствором ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре. После многократной отмывки магнитного сорбента в растворе ФСБ до нулевой экстинкции на спектрофотометре и приведения их к концентрации 1:10 в растворе ФСБ по традиционной методике выполняли ИФА, показавшему пороговую чувствительность 10³ м.к./мл, с более чем двукратным увеличением оптической плотности в опыте по сравнению с контролем.

Таким образом, заявляемый способ практически осуществим и имеет преимущество, так как обеспечивает получение сенсоров на основе кварцевых резонаторов и/или МИС с высокой стандартностью, чувствительностью, воспроизводимостью, стабильностью, демонстративностью регистрируемых результатов реакций. Применение способа возможно при конструировании гравиметрических иммуносенсоров; при разработке новых и выпуске коммерческих препаратов МИБП с более высоким уровнем эффективности их иммунологических характеристик.

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ электроиммобилизации антител. Способ включает в приложении энергии постоянного электрического поля через плоские электродыа из химически неактивного металла к электролитическому буферному раствору антител. Причём раствор антител в трис-ацетатном буфере помещают в заполненную гранулами silica gel 40 вертикальную разборную микроэлектрофоретическую камеру, заполненную гранулами silica gel 40, а частицы стандартного образца магнитного сорбента фиксируются ниобиевыми магнитами. Электродами камеры являются кварцевые резонаторы с золотым напылением. Подаваемое калиброванное электрическое поле с конститутивной удельной мощностью относительно площади поперечного сечения камеры составляет не более 2,9 Вт/см². Изобретение обеспечивает сокращение времени и повышение эффективности иммобилизации антител, а также экономии растворов антител. 5 з.п. ф-лы, 8 пр.

1. Способ электроиммобилизации антител, заключающийся в приложении энергии постоянного электрического поля через плоские электроды из химически неактивного металла к электролитическому буферному раствору антител, отличающийся тем, что раствор антител в трис-ацетатном буфере помещают в вертикальную разборную микроэлектрофоретическую камеру, заполненную гранулами silica gel 40, электродами которой являются кварцевые резонаторы с золотым напылением, подаваемое калиброванное электрическое поле с конститутивной удельной мощностью относительно площади поперечного сечения камеры составляет не более 2,9 Вт/см², а частицы стандартного образца магнитного сорбента фиксируются ниобиевыми магнитами.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что микроэлектрофоретическую камеру с буферным раствором антител, гранулами silica gel 40 помещают в однородное магнитное поле, создаваемое ниобиевыми магнитами.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что на фоне конститутивной удельной мощности электрического поля относительно поперечного сечения микроэлектрофоретической камеры прикладывают 10-кратно большие по мощности и напряженности дополнительные, совпадающие по направлению, импульсы электрического поля.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что антитела в буферном растворе иммобилизуются за счет физической сорбции на аноде и катоде.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что частицы стандартного образца магнитного сорбента в процессе обработки электрическим полем фиксируют в однородном магнитном поле за счет ниобиевых магнитов.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что частицы стандартного образца магнитного сорбента в процессе обработки электрическим полем принудительно вращали за счет изменения напряженности однородного магнитного поля путем принудительного противоположного вращения ниобиевых магнитов.