Способ электрофоретического разделения изоферментов -амилазы Советский патент 1979 года по МПК G01N27/26 

(54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ИЗОФЕРМЕНТОВоб -МШЛАЗЬ 36 Недостатком этого способа является и значительное изменение рН в процессе электрофореза, что также влияет на воспроизводимость результатов элек рофореза. Целью изобретения является повышение эффективности разделения и стабиль ocти результатов электрофореза. Это достигается тем, что электрофоретическое разделение ведут при рН 8,3-0,2 и при следующих параметрах каждого этапа: 1 этап - 20-35 кмн при плотности тока 10-12 напряжении 75-85 В; 2 этап - 30-70 мин при плотности тока 20-30 напряжении 480-520 В. Такое уменьшение плотности тока и напряжения возможно за счет повышения удельного электрического сопротив ления геля, достигаемого путем уменьшения содержания катализатора в геле в 8-10 раз. Снижение содержания катализатора в геле дало возможность по лучить гель необходимой плотности, стабилизировало его, а указанный режим электрофореза позволил разделять изоферменты на меньшей длине геля, Для повышения стабильности режима разделения рН трис(гидроксиметил)-ами нометан-глицинового электродного буфе ра в катодном и анодном резервуарах поддерживают на постоянном уровне. Это достигается увеличением концентр

ции компонентов буферного раствора вдвое по сравнению с его концентрацией по прототипу.

При осуществлении предлагаемого способа все операции выполняются в определенной последовательности. Сначала готовят полиакриламидный гель, полимеризацию которого проводят в стеклянных трубках. Затем помещают концы трубок в сосуды с электродным буфером. Не вступившие в полимеризацию вещества удаляют предварительным электрофорезом. Далее наносят белок на торцовую поверхность геля, к электродному буферу поддет постоянное напряжение, причем катодом является буфер, граничащий с торцом геля, на который нанесен белок. Электрофорез ведут при постоянном рН. После этого проявляют зоны d -амилазной активности.

Пример, Электрофорез об-амилазы зерна злаксэвых проводят следующим образом. Для приготовления геля готовят рабочие водные растворы следующего состава, вес.%: Раствор 1,

Трис(гидроксиметил)аминометан1,0

Глицин4,8

ТЕМЕД 0,23

ВодаОстальное

Раствор 2,

Акриламид30,0

Метиденбисакриламид 0,8 Мочевина20,0

ВодаОстальное

По окончании электрофореза гель извлекают из трубок и помещаиот на 1 час в холодильник в пробирках, содержащих 1%-ный крахмал на 0,1 М 5 ацетоновом буфере, рН 5,0, Затем

гель промывают водой, проявляют зоны о -амилазной активности раствором, содержащим, вес,%: ,14 и KJ 0,38 в 5%-ной трихлоруксусной кислоте, и фотографируют.

На чертеже сравниваются электрофотограммы ot-амилаз прорастающего зерна различных сортов пшеницы, полученные по предлагаемому способу:

1- с --амилаз AegiEops aucheri

Boiss, subsp. virigata Zhuko- vsky

2- oC -амилаз Ae, speEtoides

Tausch,, subsp, Eigustica Fiorivar, scandens Zhukovsky

3 cc -амилаз твердой пшеницы

Накат

4- сС -амилаз твердой плешиНцы

Мелянопус 26

5- с6-амилаз мягкой пшеницы Саратовская 29 .

Предлагаемый способ позволяет устанавливать сортовые, видовые и родовые различия апектров сб-амилазы зерна.

Способ прошел проверку в лабораторных условиях. Установлены особенности спектров оС -амилазы зерна более чем 40 сертов мягкой и твердой {пденицы и 20 видов рода Эгилопс,Полученные данные очень хорошо коррелируют с фенологическими исследованияРаствор 3. Мочевина50,0 Аммоний надсернокислый0,14 ВодаОстальное Растворы, содержащие мочевину, готовят в день использоьания, Полиакриламидный гель готовят смешиванием трех водных растворов в соотношении 2:2: 4.Смесь разливают по трубкс1М 75 мм X 5 мм. Полимеризацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин. В состав электродного буфера входит (вес.%) трис(гидроксиметил)-аминометан 0,12 и глицин 0,50. Электродный буфер применяют охлажденным до 6,0-8,ос. В качестве источника тока может служить УИП-1 (универсальный источник питания), Проводят предварительный электрофорез без нанесения белка в течение 40-60 мин при напряжении 200-250 В, Затем на гель наносят белок в 40%-кой сахарозе в количестве 50-100 мкг на трубку. Электрофорез ведут сначала при напряжении 75-85 В в течение 20- 25 мин, а затем продолжают разделение в течение 1 час при напряжении 480-520 В, Плотность тока на первом этапе не превышает 12 А/м, а на втором этапе доходит до 30 А/м, 5 ми рода Эгилопс, выполненными другим новейшими способами. Способ был использован также для выявления гибрид ных и мутантных семян пшеницы. Формула изобретения Способ электрофоретического разде ления изоферментов с« -амилазы на полиакриламидном геле, приготовленно на трис(гидроксиметил)-аминометанглициновом буфере и содержащем мочев ну и N NNN-тетраметилендиамин,о тличающийся тем, что, с целью повышения эффективности разделения и стабильности результатов. 2 6 электрофоретическое разделение ведут при рН 8,3-0,2 первые 20-35 мин при плотности тока 10-12 А/м и напряжении 75-85 В, а последующие 30-70 мин при плотности тока 20-30 напряжении 480-520 В. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Ивлев И. Доклады Болгарской Академии Наук, т. 25, № 6, с. 833- 835, 1972. 2.Перуанский Ю.В. и Фурсов О.В. Унификация методики изучения изозимов зерновых амилаз (Физиология и биохимия культурных растений, т. 6, вып. 4, 1974, с. 439-442 (прототип).

г 3 5 Г S 6 7 S3 Ю